Кластерленген тұрақты интервалмен қысқа палиндромды қайталаулар (CRISPR) - жоғары өнімділік нәтижелерімен әлемді төңкеріске ұшыратқан үшінші буын геномын редакциялау әдісі. Ол әртүрлі биологиялық аурулар мен инфекцияларды емдеу үшін қолданылған. Әртүрлі бактериялар мен басқа да прокариоттарда (мысалы, археяларда) фагтардан қорғану үшін CRISPR/Cas9 жүйелері де бар. CRISPR/Cas9 негізіндегі стратегиялар ықтимал өзгертілген төзімділік гендеріне, транскрипцияға және эпигенетикалық реттеуге бағытталған үштік теріс сүт безі қатерлі ісігінің (TNBC) өсуі мен дамуын тежей алатыны туралы хабарланды. Бұл терапиялық араласулар тіпті TNBC-де байқалатын дәрілік төзімділік сияқты күрделі мәселелерді шешуге көмектесуі мүмкін. Қазіргі уақытта CRISPR/Cas9-ды нысаналы жасушаларға жеткізу үшін әртүрлі әдістер қолданылады, мысалы, физикалық (микроинъекция, электропорация және гидродинамикалық режимдер), вирустық (адено-ассоциацияланған вирус және лентивирус) және вирустық емес (липосомалар және липидті нанобөлшектер). )-бөлшектер). TNBC молекулалық себептерін зерттеу үшін әртүрлі модельдер жасалғанымен, in vivo геномды редакциялау құралдарын жеткізудің сезімтал және мақсатты әдістерінің болмауы олардың клиникалық қолданылуын шектейді. Қорытындылай келе, бұл шолуда TNBC үшін CRISPR/Cas9 емінің прогресі, қиындықтары, шектеулері және перспективалары бар дәлелдерге негізделген жан-жақты қарастырылады. Сондай-ақ, біз жасанды интеллект пен машиналық оқытудың үйлесімі TNBC емдеуде CRISPR/Cas9 стратегияларын қалай жақсарта алатынын атап өтеміз.
Қатерлі ісік жасушалардың бақылаусыз бөлінуімен, жасуша циклінің бақылау нүктелерінің бұзылуымен және ісік супрессор гендеріндегі (ТСГ) мутациялармен сипатталады (Мэттьюс және т.б., 2022). Қатерлі ісіктің әртүрлі түрлерінің ішінде сүт безі қатерлі ісігі әйелдерде ең көп таралған қатерлі ісік түрі болып табылады және бүкіл әлемде өлім-жітім деңгейі жоғары (Waks and Winer, 2019). Сүт безі қатерлі ісігі - гистологиялық және биологиялық ерекшеліктері, клиникалық көрінісі мен мінез-құлқы, сондай-ақ емдеуге жауап беруі сияқты әртүрлі сипаттамалары бар гетерогенді ауру (Weigelt және т.б., 2010). Сүт безі қатерлі ісігінің жіктелуі сүт безі қатерлі ісігінің диагнозы мен болжамы үшін нақты түсінік береді. Жалпы биомаркерлер мен клиникалық-патологиялық ерекшеліктерді пайдалану сүт безі қатерлі ісігінің жіктелуінің негізгі критерийі болды (Tsang and Tse, 2019). Сүт безі қатерлі ісігінің болжамы мен емдеуге жауап беруіне көптеген факторлар әсер етеді, соның ішінде эстроген рецепторының (ER), прогестерон рецепторының (PR), адам эпидермальды өсу факторы 2 рецепторының (HER2/neu) болуы және гистологиялық дәрежесі, ісік түрі және дәрежесі. мөлшері және лимфа түйіндерінің метастаздары (Al-Tubaiti, 2020). Сүт безі қатерлі ісігінің бес ішкі молекулалық кіші түрі анықталды, оның ішінде люминальды А, люминальды B, HER2-мен байытылған, базальды тәрізді және клаудин-төмен (Prat et al., 2015). TNBC - барлық ER, PR және HER2 экспрессиясын білдірмейтін қатерлі ісіктің молекулалық кіші түрі (Yin et al., 2020). Бұл патологиялық ерекшеліктер TNBC-мен байланысты, бұл оның тез өршуін және кез келген басқа сүт безі қатерлі ісігінің түріне қарағанда агрессивті сипатын растайды (Feng et al., 2018). Сонымен қатар, Peru және т.б. (2000) сүт безі қатерлі ісігін қайта жіктеу және сүт безі қатерлі ісігінің бес ішкі кіші түрін анықтау үшін микрочип технологиясын қолданды (Cadenas, 2012). Базальды тәрізді сүт безі қатерлі ісігі - үш есе теріс фенотипі бар және тез өршумен байланысты сүт безі қатерлі ісігінің кіші түрі. Айта кету керек, барлық базальды тәрізді сүт безі қатерлі ісігі көбінесе TNBC ретінде қате диагноз қойылады, бірақ тек 77% TNBC болып табылады; Керісінше, TNBC-дің 71-91% базальды тәрізді, бұл сүт безі қатерлі ісігінің бұл екі түрінің бір-біріне сәйкес келетінін және әртүрлі жіктемелерді білдіретінін көрсетеді (Wang D.-Y. және т.б., 2019). Бұл болжамды анықтау және қазіргі және болашақ емдеуге ықтимал реакцияларды анықтау үшін TNBC гетерогенділігін сипаттау қажеттілігін тудырады. Сонымен қатар, TNBC барлық сүт безі қатерлі ісігінің 15-20% құрайды және 50 жасқа толмаған әйелдерде жиі кездеседі. BRCA1 немесе BRCA2 мутациялары TNBC жағдайларының шамамен 20% -ында тіркелген (Xie және т.б., 2017; Tzikas және т.б., 2017). , 2020). Зерттеулер сонымен қатар TNBC-де тамыр эндотелийінің өсу факторларының, ісікпен байланысты макрофагтардың (TAM), ісікке енетін лимфоциттердің (TIL) және ісіктің өсуі мен миграциясына қатысатын басқа молекулалардың жоғары деңгейін қамтитын ерекше иммундық микроортасы бар екенін көрсетті. Сондықтан, TNBC микроортасын түсіну оның болжамы мен емі үшін өте маңызды (Fan and He, 2022).
TNBC болжамын бағалау және тиімді емдеуді қамтамасыз ету үшін, негізінен ER, PR және HER2 анықтау үшін иммуногистохимияға (IHC) және сүт безі ісіктерін анықтау үшін маммографияға негізделген дәл диагноз қою маңызды. Дегенмен, маммография некроз және фиброз сияқты ісікішілік ерекшеліктерді жеткілікті түрде көрсете алмайды (Deepak Singh және т.б., 2021). Нашар болжам мен диагноз дәрігерлерге дұрыс дәрі-дәрмектерді тағайындауға кедергі келтіретіндіктен (Chaudhary, 2020), TNBC бар науқастарға күтімді жақсарту үшін әртүрлі стратегиялар қолданылады. Қазіргі уақытта TNBC бар науқастарда екі дәрі, доксорубицин және циклофосфамид қолданылады және жақсы нәтижелер көрсетті. Сонымен қатар, карбоплатин және цисплатин сияқты басқа платина препараттары қолданылады (Sikov және т.б., 2015). Сонымен қатар, Olaparib, Velaparib және PF-01367338 сияқты PARP ингибиторлары TNBC емдеу үшін әлеуетті химиотерапиялық препараттар ретінде қолданылды (Ishino және т.б., 2018). Wnt/b-Catenin, NOTCH және Hedgehog сигнал беру жолдарының TNBC пайда болуы мен өршуіне қатысатыны туралы хабарланғандықтан, осы жолдарға дәрі-дәрмектерді бағыттау маңызды стратегия болуы мүмкін (Aysola et al., 2013). Хирургиялық араласу, сәулелік терапия және химиотерапия бүгінгі таңда TNBC емдеудің негізгі бағыты болып қала берсе де, нысаналы терапия, иммунотерапия, Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12 сияқты CRISPR-мен байланысты гендерді редакциялау құралдары, прайм-редакциялау және CRISPR/Cas9-ны нысанаға алған гендік терапия сияқты жаңа емдеу әдістерін әзірлеуде айтарлықтай жетістіктерге қол жеткізілді. Мұнда біз TNBC емдеуде қолданылатын әртүрлі CRISPR-мен байланысты гендерді редакциялау құралдарына тоқталамыз. Олардың ішінде CRISPR/Cas9 кеңінен назар аударды.
Cas9n, Cas9 никаза деп те аталады, CRISPR/Cas9 геномын редакциялау жүйесінен алынған Cas9 ақуызының генетикалық түрлендірілген нұсқасы (Gupta et al., 2019). Бастапқы түрінде Cas9 ақуызында екі нуклеаза домені бар: RuvC және HNH, олардың негізгі қызметі екі ДНҚ тізбегінің бөлінуі. Дегенмен, Cas9n-да нуклеаза домендерінің бірі HNH генетикалық мутацияға ұшырайды және белсенді емес болып қалады. Сондықтан Cas9n-ның HNH домені жұмыс істемейді. Тек RuvC домені белсенді болып қалады, бұл Cas9n-ға жеке ДНҚ тізбектерінде үзілістерді кесуге немесе жасауға мүмкіндік береді (Trevino and Zhang, 2014). Cas9-мен салыстырғанда, Cas9n нысанадан тыс әсерлерді тиімді түрде азайтып, жасушаларды қалпына келтіру механизмдерін дәл жақсарта алады. Cas9n қос тізбекті ДНҚ-да белгілі бір жерлерде үзілістер жасау сияқты әртүрлі мәселелерді шешу үшін пайдаланылуы мүмкін. Осы мақсатта екі Cas9n молекуласы біріктіріліп, бірге қолданылды (Yee, 2016). Аралас текті киназа 3 (MLK3) - TNBC метастаздары кезінде негізгі реттегіш ретінде қызмет ететін митогенмен белсендірілген ақуыз киназа (Cronan et al., 2012).
MLK3 TNBC метастазына әкелетін бірнеше сигнал беру жолдарын белсендіре алады. Мысалы, c-Jun N-терминалды киназа (JNK) жолы жасуша қозғалғыштығын және жасушадан тыс матрицаның деградациясын реттейді, ал MLK3 JNK жолын белсендіреді, осылайша жасуша қозғалғыштығын күшейтеді және инвазивті қасиеттер береді (Rattanasinchai және Gallo, 2016). MLK3 сонымен қатар EMT-ны реттейді. Ол үшін ол Snail, Slug және Twist сияқты транскрипция факторларын белсендіреді. Бұл факторлар эпителий маркерлерінің экспрессиясын тежейді және мезенхималық маркерлердің экспрессиясын күшейтеді, бұл метастатикалық фенотиптің пайда болуына әкеледі (Casalino және т.б., 2023). MLK3 ЭКМ қайта құруда және ЭКМ-ді ыдырататын матрицалық металлопротеиназалар (MMP) сияқты протеазалардың белсенділігінде рөл атқаратыны байқалды. Бұл ісік жасушаларының инвазиясын және алыс жерлерге таралуын жеңілдетеді (Katari және т.б., 2019). Осылайша, бұрынғы зерттеулер MLK3 TNBC-де маңызды рөл атқаратынын көрсетті. Раттанасинчай мен Галло MLK3 рөлін зерттеу үшін TNBC модельдерін пайдаланды және оның белгілі бір сигнал беру жолдары арқылы қатерлі ісіктің дамуына ықпал ететінін анықтады. Олар MLK3-ті өңдеу үшін CRISPR/Cas9n қолданды және TNBC метастаздарының айтарлықтай төмендегенін байқады (Раттанасинчай және Галло, 2016).
dCas9, көбінесе белсенді емес Cas9 деп аталады, Cas9 ақуызының модификацияланған туынды түрі болып табылады. Белсенді Cas9-дан айырмашылығы, dCas9 эндонуклеаза белсенділігіне ие емес, бұл ДНҚ қос тізбекті үзілістерді тудыра алмайды. Сондықтан, dCas9 ДНҚ тізбегінде ешқандай өзгеріс немесе модификациясыз геномның белгілі бір аймақтарын дәл нысанаға алу үшін пайдаланылуы мүмкін (Wang et al., 2016). dCas9-да екі эндонуклеаза ақуызы, RuvC және HNH, маңызды аминқышқылдарының қалдықтарын басу арқылы белсенді емес. (Richter et al., 2016). ДНҚ бөлшектеу белсенділігінің болмауына қарамастан, dCas9 генетикалық зерттеулер мен биотехнологияда бірқатар маңызды рөл атқарады. Мысалы, ол геномның белгілі бір аймақтарын визуализациялауға мүмкіндік береді, транскрипциялық реттеуді жеңілдетеді және эпигенетикалық модификацияларды ілгерілетеді (Brocken et al., 2018).
ZEB1 транскрипция факторы (мырыш саусағындағы E-қорапты байланыстыратын гомеобокс 1) эмбриондық даму, тіндердің қалпына келуі және қатерлі ісіктің өршуі кезінде жүретін жасушалық процесс - эпителий-мезенхималық ауысуды (ЭМӨ) медиациялауда ерекше және маңызды рөл атқарады. Бұл эпителий жасушаларының мезенхималық жасушаларға айналуын қамтиды, бұл жасуша морфологиясының, қозғалғыштығының, инвазивтілігінің және т.б. өзгеруіне әкеледі (Wu және т.б., 2020). ZEB1 TNBC-де эпителий жасушаларының жасуша-жасуша адгезиясын және полярлығын сақтауға жауапты E-кадгерин және окклюдин сияқты бірнеше эпителий маркерлерін тежейді (Moreno-Bueno және т.б., 2008). Сонымен қатар, ZEB1 N-кадгерин, виментин және фибронектин сияқты белгілі бір маркерлерді белсендіреді (Konradi және т.б., 2014), сондай-ақ Rho GTPaza және матрицалық металлопротеиназалар (MMPs) сияқты цитоскелеттік қайта құруға қатысатын гендерді реттейді (Huang). және т.б., 2014). 2022), сонымен қатар, ол трансформациялық өсу факторы-β (TGF-β), Wnt сигнализациясы және т.б. сияқты әртүрлі сигнал беру жолдарына әсер етеді, осылайша TNBC-де ісік инвазиясын және метастазды күшейтеді (Chen және т.б., 2016). Көптеген зерттеулер мен ғылыми дәлелдер ZEB1-дің TNBC анықтау және терапиялық араласу үшін құнды агент ретінде үлкен әлеуетке ие екенін көрсетеді. Жақында жүргізілген зерттеуде Waryah және т.б. TNBC моделін қолданды және dCas9 арқылы ZEB1-ді толық басуға қол жеткізді. Осылайша, олар in vivo жағдайларында ZEB1-дің өте жоғары ерекшелігін және толық дерлік тежелуін байқады (Waryah және т.б., 2023).
CRISPR/Cas12 - CRISPR/Cpf1 деп аталатын генді редакциялау құралы. Ол CRISPR/Cas жүйесінен шыққан, мұндағы Cas12 термині Cas9-ға толығымен ұқсас CRISPR-мен байланысты 12 ақуызын білдіреді (Bharathkumar және т.б., 2022). Жалғыз айырмашылығы - оның құрамында Cas12 ақуызы бар. Cas9-мен салыстырғанда, Cas12 генді редакциялау процесінде жабысқақ ұштарды генерациялау сияқты бірегей функцияларға ие, ал Cas9 доғал ұштарды генерациялайды (Wang және т.б., 2021). Cas12-нің бұл қасиеті оның ДНҚ-ны манипуляциялаудың ерекше технологиясына ықпал етеді. Нысана ДНҚ-ны дәл тануға және кесуге қабілетті ақуыз ретінде ол ерекше жан-жақтылыққа ие, бұл оны генді редакциялауды қоса алғанда, әртүрлі қолданбалар үшін тиімді құрал етеді (Pickar-Oliver және Gersbach, 2019).
Басқа CRISPR нұсқаларына ұқсас, CRISPR/Cas12 TNBC-дегі гендерді нокаутқа түсіруге немесе белсендіруге қабілетті, оның патогенезінде немесе емдеуге реакциясында маңызды рөл атқаратын гендерді нысанаға алады (Yang және Zhang, 2023). Бұл процесті орындау үшін Cas12-ні нысана геніне бағыттайтын бағыттаушы РНҚ (gRNA) жасалды. Cas12 нысанасына байланысқаннан кейін, ол ДНҚ-да қос тізбекті үзілістерді енгізеді және ДНҚ-ны қалпына келтіру механизмдерін белсендіреді. Қалпына келтіру процесінде дұрыс емес нуклеотидтер енгізілуі мүмкін, бұл ген мутацияларына және функцияның жоғалуына әкеледі (Zhang және т.б., 2021a). Сонымен қатар, гендерді белсендіру үшін Cas12 ферментінің жақсартылған нұсқасы (dCas12 деп аталады) да қолданылды. Оны транскрипция активаторымен біріктіру арқылы белгілі бір гендерді индукциялауға, осылайша оларды белсендіруге болады. Бұл технология ісік басатын гендердің белсенділігін арттыруда үлкен әлеуетке ие (Sultan және т.б., 2022).
Прайм-редакторлау - жаңадан жасалған және өте жоғары сапалы геномды редакциялау технологиясы. Ол организмнің ДНҚ-сын өте дәл өзгертуге қабілетті (Chen және Liu, 2023). Прайм-редакторлау екі негізгі компонентті біріктіру арқылы жүзеге асырылады: модификацияланған CRISPR/Cas9 ферменті және кері транскриптаза. CRISPR/Cas9 ферментінің рөлі - геномдағы нақты орындарды таңдамалы түрде нысанаға алу, ал кері транскриптаза ДНҚ-ны мақсатты жерде мұқият өзгертуге көмектеседі (Hassan және т.б., 2021). Прайм-редакторлау механизмінде бірінші қадам праймер-редакторлау нұсқаулығы РНҚ-ны (pegRNA) жасауды қамтиды (Standage-Beier және т.б., 2021). Онда мақсатты ДНҚ-дағы қажетті редакциялау орнына сәйкес келетін нысана тізбегі және РНҚ үлгісі бар. Содан кейін pegRNA мақсатты жасушаларға праймер-редакторлау нуклеазасымен (PE2) бірге енгізіледі. PE2 - Cas9 ферментінен, кері транскриптазадан және праймер-редакторлау адаптерінен тұратын біріктіру ақуызы (Martín-Alonso және т.б., 2021). Жасуша ішінде pegRNA және PE2 кешендерінің модификациялауы қажет нақты ДНҚ-ны іздейді. Cas9 ферменті ДНҚ-ны кесіп, бір тізбектен тұратын үлгі жасайды (Choi et al., 2022). Кері транскриптаза бұл үлгіні ДНҚ-ны редакциялауға дайындау үшін пайдаланады. ДНҚ-ны көшірумен қатар, РНҚ үлгісін редакциялау нұсқаулары да берілген. Соңында, жаңадан жасалған ДНҚ тізбегі ДНҚ-дағы үзілісті қалпына келтіру үшін үлгі ретінде пайдаланылады, нәтижесінде қажетті модификацияны қамтитын өзгертілген ДНҚ тізбегі пайда болады (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Праймерді редакциялау механизмдері гендердегі кең таралған мутацияларға әкелуі мүмкін. Ол нүктелік мутацияларды, инсерцияларды, делецияларды және тіпті генді алмастыруларды нысанаға ала алады (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). Праймды редакциялау бұрынғы геномды редакциялау технологияларына қарағанда бірнеше артықшылықтар ұсынады. Оларға дәлдіктің жоғарылауы, нысанадан тыс әсерлердің азаюы және ДНҚ-ның қос тізбекті үзілістеріне сүйенбей ДНҚ-ны редакциялау мүмкіндігі жатады (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9 технологиясы бастапқыда бактерияларды плазмидалық тасымалдаудан және фаг инфекциясынан қорғау үшін жасалған және кейінірек геномды редакциялау үшін тиімді РНҚ негізіндегі ДНҚ нысаналау құралы ретінде қайта пайдаланылды (Jiang and Doudna, 2017). Сонымен қатар, CRISPR/Cas9 жүйесінің бактериялық және архиялық геномдардың сәйкесінше 50% және 87% -ында бар екені туралы хабарланған (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 - in vivo және in vitro режимдерін қолдана отырып, кез келген ауытқуы бар генетикалық тізбекті жою, енгізу және түзету үшін әлеуетті құрал (Sabit et al., 2021). Сонымен қатар, CRISPR/Cas9 қызығушылық тудыратын нысана гендеріне тән ерекшелігіне байланысты адаптивті иммундық жүйенің бөлігі екені көрсетілген (Chen and Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 Cas9 және бір бағыттаушы РНҚ-дан (sgRNA) тұрады. Cas9 - бірнеше ақуыз компоненттерінен тұратын эндонуклеаза. Сонымен қатар, Cas9 екі бөліктен тұратындықтан, бірегей құрылымдық және конформациялық қасиеттерге ие (Pacesa және т.б., 2022). REC бөлігі одан әрі үш аймаққа бөлінеді: REC1, REC2 және көпір спиральдары (Cromwell және т.б., 2018). NUC үш бөліктен тұрады, атап айтқанда RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH және протоспейсердің көршілес мотиві (PAM) өзара әрекеттесу домені (1-сурет) (Song және т.б., 2016). sgRNA екі компоненттен тұрады, оның ішінде CRISPR РНҚ (crRNA) және транскодтаушы кіші РНҚ (іздеуші РНҚ) (1-сурет). sgRNA Cas9 ақуын коннексиндермен байланыстырып, белсенді кешен түзеді, ол эффекторлық кешен деп те аталады (Richter et al., 2012). crRNA - нысаналы ДНҚ тізбектерін тануда маңызды рөл атқаратын 18-20 нуклеотидтік базалық жұп. Сонымен қатар, crRNA нысаналы ДНҚ-мен жұптасады, ал tracrRNA Cas9 нуклеазасының нысаналы ДНҚ-мен байланысуы үшін тірек ретінде қызмет етеді (Manghwar et al., 2019). Екінші жағынан, PAM тізбегінде 3 нуклеотид бар, бұл эффекторлық кешеннің ДНҚ-мен байланысуын растайды, анықтайды және делдалдық етеді. Cas9 ақуыздық кешенінің RuvC және HNH қосалқы бөліктері каталитикалық белсенділікке ие (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). Cas9 қосалқы бөлігінің HNH нуклеаза домені crRNA-мен байланысты ДНҚ тізбегін бөледі. RuvC нуклеаза домені басқа ДНҚ тізбектерін бөліп, қос тізбекті үзілістерді (DSB) тудырады, содан кейін екі түрлі ДНҚ үзілісін қалпына келтіру механизмдері іске қосылады (Цзян және Дудна, 2017) (1-сурет).
1-сурет. CRISPR/Cas9-ға шолу (A). CRISPR/Cas9 жүйесінің компоненттері: (i). Cas9 эндонуклеазасы мақсатты ДНҚ тізбегін кесуге, (ii) crRNA және tra-crRNA химераларының бірігуінен пайда болатын бір бағыттаушы (sg) РНҚ-ны кесуге жауапты. (екі). Cas9 құрамына Rec I, Rec II, NUC лоб (HNH және Ruv C қосалқы компоненттер) және сәйкес функциялары бар PAM өзара әрекеттесу домені (C) сияқты бірнеше компоненттер кіреді. CRISPR/Cas9 ақуыз кешені ДНҚ тізбектерін комплементарлы емес және комплементарлы формаларға бөледі (D). CRISPR/Cas9 геномды үш кезеңде өңдейді: тану, кесу және қалпына келтіру. Жобаланған sg-РНҚ Cas9-ды бағыттайды және комплементарлы компонент crRNA арқылы қажетті тізбекті таниды. Cas9 PAM тізбегін 5′-NGG-3′-да таниды және ДНҚ-ны балқытады, ДНҚ-РНҚ гибридін түзеді және бөлінуді белсендіреді. Cas9-дың HNH домені комплементарлы тізбекті, ал RuvC домені комплементарлы емес тізбекті бөледі. CRISPR/Cas9 dsДНҚ-ны екі жолмен бұзу арқылы қалпына келтіреді: гомологиялық емес ұштық қосылыс (NHEJ) және гомологияға бағытталған қалпына келтіру (HDR). NHEJ бөгде гомологиялық ДНҚ болмаған кезде қос тізбекті ДНҚ-ны ферментативті процесс арқылы қалпына келтіреді, бұл кездейсоқ ДНҚ тізбектерін енгізе немесе алып тастай алатын қателікке бейім механизм. HDR өте ерекше және гомологиялық ДНҚ шаблондарын қажет етеді.
CRISPR/Cas9 арқылы жүзеге асырылатын қалпына келтіру жолдарына гомологиялық емес ұштық қосылу (NHEJ) және гомологияға бағытталған қалпына келтіру (HDR) механизмдері кіреді. NHEJ қателікке бейім жол болып табылады, себебі ол енгізуді немесе жоюды қамтиды және қалпына келтіру механизмі кезінде ешқандай үлгіні қажет етпейді. Ол стандартты ақуыздарды генерациялау үшін кездейсоқ нуклеотидтерді пайдаланады (Abbasi және т.б., 2021). Бұл қалпына келтіру жүйесі KU кешені, 4 типті айқас комплементацияланатын ақуыз кешені (XRCC-4), ДНҚ соңын өңдеу ферменті және ақуыз киназасы ДНҚ-PKcs сияқты төрт кешеннен тұрады (Abbasi және т.б., 2021). KU кешенінің ақуызының екі суббірлігі бар: Ku 70 және Ku 80 және NHEJ механизмінде маңызды рөл атқарады, себебі қалпына келтіру механизмі екі суббірліктің (Ku 70 және Ku 80) нысана ДНҚ-ның доғал немесе доғал ұштарына байланысуынан басталады (Abbasi және т.б., 2021), бұл жарақат орнына басқа NHEJ-мен байланысты факторларды тарту үшін тірек қызметін атқарады (Yang және т.б., 2020). XRCC-4 және ДНҚ лигазалары сәйкесінше 334 және 911 аминқышқылдарынан тұрады, ал XRCC4-ДНҚ лигаза IV кешені ДНҚ ұштарының лигациясын ынталандырады (Chatterjee және т.б., 2015). ДНҚ соңғы өңдеу ферменті, сондай-ақ полинуклеотидтік киназа 3′-фосфат деп аталады, ДНҚ соңғы өңдеу ферменті болып табылады. Ол ДНҚ-дағы 3′P тобын алып тастай алады және DSB қалпына келтіру кезінде 5′OH тобын фосфорлай алады. Сондай-ақ, бұл SSB қалпына келтіру жолын пайдаланып, бір тізбекті үзілістерді (SSB) қалпына келтіруді қамтиды (Chatterjee et al., 2015). Ақуыз киназасы ДНҚ-PKcs - бұл PIKK-лардың (фосфатидилинозитол 3-киназамен байланысты киназалар) және атаксия телангиэктазия мутацияланған (ATM) тұқымдасының каталитикалық суббірлігінен, сондай-ақ ATM және Rad3-мен байланысты ATR-лерден тұратын ДНҚ-ға тәуелді ақуыз киназасы. Тізбекті үзілістер (DSB) және бір тізбекті үзілістер (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR дәлірек және қолайлы қалпына келтіру механизмі болып табылады, себебі ақпарат гомологиялық ДНҚ дуплексінің бүтін түрін пайдаланып көшіріледі, дегенмен ол апалы-сіңлілі хроматидтердің қатысуын талап етеді. Бұл сүтқоректілердің жасуша циклінің S/G2 фазасында орын алады. HDR негізінен ашытқы түрлерінде кездеседі, бірақ NHEJ сүтқоректілерде өте маңызды (Burma және т.б., 2006; Abbasi және т.б., 2021). Толық қалпына келтіру механизмі 1-суретте көрсетілген.
TNBC генетикалық және эпигенетикалық ауытқулардан туындайтындықтан, CRISPR/Cas9 көмегімен қатерлі геномдық/эпигеномдық ауытқуларды түзету ақылға қонымды терапиялық тәсіл болуы мүмкін (Chen және т.б., 2019). Сонымен қатар, жасушаға тән транскрипциялық реттеуге қатысатын кейбір транскрипция факторлары қатерлі ісік жасушаларының бірегей сипаттамаларын көрсетуі мүмкін, бұл транскрипциялық реттеу қатерлі ісікті емдеу үшін тамаша тәсіл болуы мүмкін екенін көрсетеді (Drost және т.б., 2017). Дәрілік заттарды әзірлеу үшін ісіктердің осы молекулалық ерекшеліктерін, мысалы, генетикалық, эпигенетикалық және транскрипциялық ақауларды пайдалану клиникалық нәтижелерді жақсартып, скринингтік шығындарды азайта алады. CRISPR - қатерлі ісік тудыратын геномдық нысаналарды анықтап, анықтай алатын, сонымен қатар адам жасушаларындағы онкогендерді өңдеу, басу және эпигенетикалық түрде өзгерту үшін де пайдаланылуы мүмкін генді редакциялау құралы (1-кесте) (Ahmed және т.б., 2021). Ісік супрессорларымен, онкогендермен және дәрілік төзімділікпен байланысты гендерді іздеу үшін бірнеше CRISPR скринингтері жүргізілді. Әртүрлі TNBC онкогендерін өңдеу үшін CRISPR/Cas9 қолдану 2-суретте көрсетілген.
2-сурет. CRISPR/Cas9 көмегімен әртүрлі TNBC онкогендерін гендік редакциялау ісіктің өсуі мен метастазының төмендеуіне әкеледі. Бұл онкогендерге TNBC пайда болуы мен метастазына қатысатын CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 және CXCR7, Crypto1, ROR1 және ST8SIA жатады.
Қатерлі ісік жасушаларының миграциясы, инвазиясы және эпителий-мезенхималық ауысуы (ЭМТ) ITGA9-мен байланысты. Алдыңғы зерттеулер ITGA9-дың Notch жолында негізгі рөл атқаратынын және рабдомиосаркома метастазында қызықты рөл атқаратынын көрсетті (Molist және т.б., 2020). Сонымен қатар, ITGA9 сүт безі қатерлі ісігін қоса алғанда, бірнеше ісік түрлерінде пациенттердің болжамымен тығыз байланысты екені анықталды (Wang Z. және т.б., 2019). Сонымен қатар, ITGA9 биоинформатикалық талдауы оның TNBC-дегі экспрессиясы сүт безі қатерлі ісігінің басқа кіші түрлеріне қарағанда айтарлықтай жоғары екенін көрсетті. ITGA9 деңгейінің жоғарылауы TNBC пациенттерінде ісік метастаздарымен және рецидивімен байланысты. CRISPR/Cas9 арқылы ITGA9-ды нокаутқа жіберу қатерлі ісік бағаналы жасушаларына (CSC) ұқсас қасиеттерге, ісік ангиогенезіне, ісіктің өсуіне және TNBC-де β-катениннің ыдырауын ынталандыру арқылы метастаздың төмендеуіне әкелді (Wang Z. және т.б., 2019).
Крипто-1 TGF-β тұқымдасының мүшесі болып табылады және ерте эмбриогенез, бағаналы жасушаларды сақтау және қатерлі ісік метастаздары үшін өте маңызды (Ishii және т.б., 2021). Tdgf-1 деп те аталатын бұл онкогенді GPI-мен бекітілген сигнал беру ақуызы, ол алғашқы жолақтың, мезодерма мен эндодерманың түзілуін реттеуге, сондай-ақ эмбриогенез кезінде дене мүшелерінің дамуында сол/оң асимметрияның орнатылуына қатысады (Zhang және т.б., 2021b). Сонымен қатар, Cripto-1 бағаналы жасуша маркері ретінде эпителий-мезенхималық ауысуға (ЭМТ) қатысатыны көрсетілген (Zhang және т.б., 2021b). ЭМТ тек эмбриондық даму, фиброз және жаралардың жазылуы сияқты әртүрлі процестер үшін ғана емес, сонымен қатар қатерлі ісік инвазиясы мен метастаздары үшін де маңызды. Сонымен қатар, Cripto-1 төрт Notch рецепторымен әрекеттесетіні және олардың трансляциядан кейінгі жетілуін күшейтетіні көрсетілген (Brandstadter және Maillard, 2019). Notch сигнал беру жолы адамның сүт безі қатерлі ісігі жасушаларын сақтауға қатысатыны белгілі. Зерттеулер CRISPR/Cas9 арқылы Crypto-1 нокаутының қатерлі ісіктің өсуі мен метастаздарын басатынын көрсетті. Сондықтан, Crypto-1 TNBC үшін маңызды терапиялық нысанаға айналуы мүмкін (Castro et al., 2015).
XCL12 ақуызы және оның хемокин рецепторы CXC (CXCR4 және CXCR7) қатерлі ісік жасушаларының көбеюінде, өсуінде, миграциясында және инвазиясында әртүрлі рөл атқарады (Wu және т.б., 2015). Бұл хеморецепторлар in vivo және in vitro модельдерінде бірнеше сигнал беру жолдары арқылы TNBC дамуымен байланысты болды (Wu және т.б., 2015). Сонымен қатар, CXCR4 және CXCR7 белсендірілуі TNBC-де метастазға жоғары сезімталдықпен және нашар болжаммен байланысты (Karn және т.б., 2022). Сондықтан, CXCR4 және CXCR7 нокауттары TNBC-ді қоса алғанда, сүт безі қатерлі ісігін емдеу үшін тиімді дәрілік нысана гендеріне айналуы мүмкін. Yang және т.б. зерттеуі. Yang және т.б. (2019) CXCR4 және CXCR7 гендерін бірлесіп нокаутқа түсіру үшін CRISPR/Cas9 қолданды және TNBC пролиферациясы, өсуі, миграциясы және инвазиясы айтарлықтай тежелетінін анықтады (Yang және т.б., 2019).
Сүт безі қатерлі ісігінің тіндерінде TNBC онкогені болып табылатын miR-3662 деңгейінің жоғарылауы байқалды (Yi және т.б., 2022). miR-3662-нің нокдаунының сүт безі қатерлі ісігі ісіктерінің өсуін және метастазасын in vivo және in vitro тежейтіні көрсетілген (Agarwal және Gupta, 2021). HBP-1 Wnt/-катенин сигнализациясының күшті ингибиторы болып табылады және TNBC жасушаларының miR-3662 арқылы өсуіне жауапты болуы мүмкін. Жақында Yi және т.б. miR-3662-HBP1 осі TNBC жасушаларындағы Wnt/-катенин сигнализация жолын реттейтінін анықтады (Yi және т.б., 2022). Ісікке тән экспрессиясына байланысты miR-3662 TNBC үшін әлеуетті терапиялық нысана болуы мүмкін. Осылайша, miR-3662-нің CRISPR/Cas9 арқылы нокдауны TNBC емдеуге арналған жаңа препараттарды әзірлеудің тамаша тәсілі болуы мүмкін.
UBR5 - әртүрлі қатерлі ісіктерде ісіктің пайда болуының, метастаздың және иммундық жауаптың негізгі реттеушісі ретінде анықталған 300 кДа нуклеофосфопротеин (Shearer және т.б., 2015; Fu және т.б., 2023). UBR5 TNBC үлгілерінде жоғары реттелетіні және убиквитин лигаза белсенділігі арқылы пролиферацияны индукциялау арқылы ERα функциясын ынталандыратыны туралы хабарланған (Bolt және т.б., 2015). Бастапқы TNBC үлгілерінің экзомдық секвенирлеу бойынша толық зерттеулері UBR5 экспрессиясының жоғарылауын көрсетті, бұл оның TNBC дамуындағы рөлін көрсетеді. Сонымен қатар, CRISPR/Cas9 арқылы UBR5 жойылуы эксперименттік тышқан модельдерінде TNBC метастазының және өсуінің айтарлықтай тежелуін көрсетті. Сонымен қатар, жабайы типті тышқан моделіне UBR5 қосу оның толық функционалдығын қалпына келтірді, ал бұл әсер белсенді емес мутантты штамдарда байқалмады (Liao және т.б., 2017). UBR5 жетіспеушілігі TNBC-де апоптоздың, некроздың жоғарылауымен және ангиогенездің нашарлығына байланысты ісік өсуінің тежелуімен байланысты. UBR5 жоғалуына байланысты ісіктің алыс органдарға таралуы азаяды және UBR5 негізінен E-кадгерин экспрессиясын төмендету арқылы қалыптан тыс EMT тудырады (Zhang and Weinberg, 2018). Жақында UBR5 TNBC-де IFN-γ индукцияланған PDL1 транскрипциясында E3 убиквитиндеу белсенділігінің болмауына байланысты өте маңызды фактор болып табылатыны көрсетілді. РНҚ транскриптомын талдау UBR5 IFN-γ жолымен байланысты гендерге жүйелік әсер етуі және ақуыз киназа РНҚ (PKR) және оның сигнал түрлендіргіштері мен активаторларының белсендіру деңгейін арттыру арқылы PDL1 трансактивациясын күшейтуі мүмкін екенін көрсетті. транскрипция 1 (STAT1) және интерферонды реттеуші фактор 1 (IRF1). Дегенмен, CRISPR/Cas9 арқылы UBR5 және PD-L1 экспрессиясының біріктірілген абляциясы екі блокаданың өздігінен қолданылуына қарағанда синергетикалық терапиялық әсерге ие, ісік микроортасына терең әсер етеді (Wu және т.б., 2022). Осылайша, CRISPR/Cas9 UBR5 функциясын тежеудің, осылайша TNBC метастазын және ісіктің өсуін басудың маңызды құралы болуы мүмкін.
ROR1 - қатерлі ісік және эмбриондық даму кезінде экспрессияланатын және онкофетальды ақуыз ретінде анықталған I типті трансмембраналық ақуыз (Nicholas Borcherding, 2014). Әртүрлі адам қатерлі ісіктерінің инвазивті мінез-құлқы ROR1-дің жоғарылауымен байланысты. ROR1-ге бағытталған терапиялық қосылыстарды қамтитын in vivo және in vitro зерттеулерінен үміт күттіретін нәтижелер алынды (Chien және т.б., 2016). Сүт безі тінінің биопсияларындағы ROR1 мРНҚ деңгейінің жоғарылауы агрессивті базальды тәрізді сүт безі (BL) ісіктерімен және олардың дененің басқа бөліктеріне көшуімен де байланысты болды. Сонымен қатар, ROR1-дің шамадан тыс экспрессиясы TNBC дамуының болжамдық маркері ретінде анықталды (Chien және т.б., 2016). Дегенмен, TNBC өсуі мен метастазын басу үшін CRISPR/Cas9 көмегімен ROR1-ді өшіру тиімді стратегия болар еді.
Сиалилдеу процесі гликоконъюгаттарға сиал қышқылын қосуды қамтиды, ол сиалилтрансферазалармен (ST) катализденеді. ST8SIA1 ST тұқымдасына жатады және лимфоцитарлық лейкемия және тоқ ішек қатерлі ісігі сияқты әртүрлі аурулардың патогенезінде маңызды рөл атқарады (Chang және т.б., 2018). РНҚ тізбекті талдауы ST8SIA1 TNBC пациенттерінің сүт безі тінінде жоғары экспрессияланатынын және TNBC патогенезіне ықпал етуі мүмкін ісік супрессоры генінің p53 мутацияларымен оң корреляцияланғанын көрсетеді (Battula және т.б., 2017). Сонымен қатар, ST8SIA1 TNBC метастаздары мен қайталануына қатысады, бұл оның TNBC пайда болуы мен дамуында маңызды рөл атқаратынын көрсетеді. TNBC in vitro моделінде CRIPSR/Cas9 арқылы ST8SIA1 нокдаунының өсу мен метастазды блоктайтыны көрсетілген (Battula және т.б., 2017). Бұл CRISPR/Cas9 TNBC емдеуде ST8SIA1 онкогенінің қызметін тежеу үшін маңызды құрал болуы мүмкін екенін көрсетеді.
NAT1 - II фазалы ксенобиотикалық қосылыстардың түзілуін катализдейтін метаболикалық фермент және адам тіндерінің барлығында дерлік экспрессияланады. NAT1 хош иісті амин субстраты болмаған кезде де ацетил-КоА (ацетил-КоА) нысанаға алу үшін кофактор фолатты пайдалана алады (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Зерттеулер NAT1 сүт безі қатерлі ісігі жасушаларының модельдеріндегі матрицалық металлопротеиназа 9 (MMP9) функциясын реттейтінін және глюкоза аштығы кезінде реактивті оттегі түрлерінен (ROS) қорғайтынын көрсетті (Wang et al., 2018). NAT1-ді жою пируватдегидрогеназа кешенін тежейтіні, бұл митохондриялық дисфункцияға әкелетіні көрсетілген (Wang L. et al., 2019). Сонымен қатар, басқа да әртүрлі есептер шағын молекулаларды және siRNA-ны өшіруді қолдана отырып, NAT1 тежелуі сүт безі қатерлі ісігі жасушаларының инвазивтілігі мен көбеюін төмендетуі мүмкін екенін көрсетті (Stepp et al., 2018). Жақында CRISPR/Cas9 сүт безі қатерлі ісігінің жасуша желісіндегі MDA-MB-231-де NAT1-ді басу үшін қолданылды, бұл оның экспрессия деңгейіне байланысты жасушалық метаболизмге әсер етеді. Бұл зерттеу сонымен қатар NAT-1 TNBC прогрессиясы мен метастаздары үшін маңызды екенін көрсетті (Carlisle et al., 2020).
Онкогендердің үйлесімді транскрипциясы суперэнхансерлермен, транскрипция факторларымен және кофакторлармен реттеледі (Hnisz және т.б., 2015). Сонымен қатар, транскрипциялық реттеу үшін CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 және CDK13 сияқты циклинге тәуелді киназалар (CDK) тобы қажет. Олардың ішінде CDK7 РНҚ-полимераза II фосфорлануына қатысады, бұл TNBC патогенезінде онкоген транскрипциясының басталуы және кеңеюі үшін өте маңызды. Негізгі зерттеуде CRISPR/Cas9 арқылы CDK7 делециясы TNBC-ні тежеді, бұл TNBC патогенезінің CDK7-ге тәуелді екенін көрсетеді (Wang Y. және т.б., 2015).
Зерттеулер MYC және RBP (РНҚ байланыстырушы ақуыз) мутацияларының апоптозға әкелуі мүмкін екенін, ал MYC немесе RBP-дегі жеке ген мутацияларының қатерлі ісік жасушаларының өсуіне әсер етпейтінін көрсетті (Эйнштейн және т.б., 2021). Адам геномындағы 1000-нан астам RBP CRISPR/Cas9 негізіндегі кітапхананы пайдаланып тексерілді. Олардың ішінде 57 RBP MYC деңгейі жоғары қатерлі ісік жасушаларының өсуі үшін маңызды екені анықталды (Wheeler және т.б., 2020). Сонымен қатар, YTHDF2 TNBC жасушаларының өсуін сақтау үшін маңызды және MYC экспрессиясы жоғары қатерлі ісік жасушаларында жоғары деңгейлі транскрипция мен трансляция кезінде метилденген транскрипттердің мөлшерін азайтады. Сонымен қатар, YTHDF2 TNBC пациенттерінің өмір сүру ұзақтығын ұзарту үшін MYC деңгейінің жоғарылауына аз тәуелді қатерлі ісік жасушалары үшін маңызды емес (Эйнштейн және т.б., 2021), бұл оның TNBC-ді жеңе алатын дәрілер үшін әлеуетті терапиялық нысана болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Мырыш саусақ ақуыздары (ZNF) адам геномының жалпы көлемінің шамамен 1%-ын құрайды. Зерттеулер ZNF бауыр обыры, сүт безі обыры және тоқ ішек обыры сияқты әртүрлі қатерлі ісіктерде жасушалардың көбеюін реттей алатынын көрсетті (Zhang W. және т.б., 2021; Li және т.б., 2017). CRISPR нокаутымен жасалған кітапханалар сүт безі обыры жасушаларындағы әртүрлі ісік супрессорлық гендерді (TSG) скринингтеу үшін пайдаланылды (Shalem және т.б., 2014). Содан бері CRISPR/Cas9 ZNF319 жойылған сүт безі обыры жасушаларының транскриптомиялық зерттеуі ZNF319 сүт безі обырының көбеюін азайтатын ісік супрессорлық гені екенін және сондықтан әртүрлі әлеуетті сигнал беру механизмдері мен басқа да биологиялық функцияларға қатысатынын көрсетті (Wang L. және т.б., 2022).
Ферроптоз - темірдің болуына тәуелді бағдарламаланған жасуша өлімінің бір түрі. Ферроптоздың дамуына липидтік асқын тотықтардың болуы әсер ететіні белгілі. Сонымен қатар, PKCβII ерте липидтік асқын тотығуды көрсететіні туралы хабарланған, ал липидтік асқын тотығудың жоғарылауы ферроптозбен байланысты. CRISPR/Cas9 арқылы жүзеге асырылатын киназа ингибиторларының кітапханасын скринингтеу PKCβII липидтік асқын тотығу процесіне қатысатынын көрсетті, бұл MDA-MB-231 жасушаларындағы ферроптоз үшін өте маңызды (Zhang et al., 2022). Демек, бұл CRISPR/Cas9 арқылы PKCβII нокаутқа ұшырауы ферроптозбен байланысты ауруларды емдеу үшін ісік супрессоры генінің нысанасы болуы мүмкін екенін көрсетеді (Zhang et al., 2022).
Дәрілік төзімділік қатерлі ісікпен ауыратын науқастардағы өлімнің шамамен 90%-ына жауапты деп есептеледі және қатерлі ісікті емдеудегі негізгі қиындықтардың бірі болып табылады (Bukowski және т.б., 2020). Нәтижелер дәрілік заттардың ағып кетуіне, ДНҚ-ны қалпына келтіруге, апоптозға және әртүрлі жасушалық сигнал беру жолдарына байланысты гендердің жеткілікті саны дәрілік төзімділікпен байланысты екенін көрсетеді (Haider және т.б., 2020). Олардың ішінде бірнеше гендер CRISPR/Cas9 құралдарымен нысанаға алынды және дәрілік төзімділікті төмендетуде және қатерлі ісікке қарсы емдеудің тиімділігін арттыруда перспективалы нәтижелер көрсетті (Vaghari-Tabari және т.б., 2022). Сонымен қатар, жоғары өнімді CRISPR/Cas9 гендік нокаут скринингтік кітапханалары дәрілік төзімділік генінің әлеуетті нысаналарының функциясын өзгертуге қатысты болды (Shalem және т.б., 2015). Паклитакселге төзімділік гендерін анықтау үшін, қайталанатын TNBC бар науқастарда дәріге төзімділікпен байланысты сегіз кандидат генді, соның ішінде гистон деацетилаза 9 (HDAC9) анықтау үшін геном бойынша sgRNA кітапханасын скринингтеумен бірге РНҚ секвенирлеу қолданылды (B және т.б., 2020). Басқа бір зерттеуде қатерлі ісікке қарсы препараттармен емделген TNBC бар науқастардың өмір сүру кезеңінде дизерин/треонин және тирозин протеинкиназасының (DSTYK) экспрессиясының жоғарылауы байқалды. Сонымен қатар, DSTYK-тің CRISPR/Cas9 арқылы нокдауны дәріге төзімді қатерлі ісік жасушаларының in vitro (SUM102PT жасушалары және MDA-MB-468 жасушалары) және in vivo TNBC моделінің апоптозын айтарлықтай күшейтті (Ogbu және т.б., 2021).
TNBC MAPK жолының қалыптан тыс белсенділігіне ие болғанымен, MEK-бағытталған терапияның клиникалық әсері нашар. CRISPR/Cas9 геномдық кітапханасының скринингі PSMG2 (протеом құрастыру шапероны 2) тежелуінің TNBC BT549 және MB468 жасушаларын MEK ингибиторы AZD6244-ке сезімтал ететінін көрсетті. PSMG2-нің CRISPR/Cas9 нокдауны қалыпты протеасома функциясын өзгертті, бұл PDPK1-дің аутофагия арқылы бөлшектенуіне әкелді, осылайша AZD6244 (MEK ингибиторы) және MG132 (протеасома ингибиторы) индукциялаған TNBC тышқан модельдеріндегі ісік жасушаларын одан әрі жақсартты. Осылайша, протеасома мен MAP киназа (MEK) ингибиторларын ісік жасушаларының көбеюін азайту үшін синергетикалық түрде енгізуге болады (Wang X. және т.б., 2022).
CRISPR/Cas9 сонымен қатар TNBC төзімділігіне әкелетін ген функциясының жоғалуын скринингтеу үшін қолданылды (Shu және т.б., 2020). Ge және т.б. TNBC-де BET бромодомен ингибиторы (BBDI) JQ1-мен емделген қатерлі ісік жасушаларының дәріге төзімділік механизмін түсіндірді. CRISPR/Cas9-ды қолдана отырып, олар rb1 генін жою TNBC-нің қатерлі ісікке қарсы JQ1 препаратына төзімді болуына әкелетінін анықтады. Сондықтан, rb1 функциясы TNBC-де JQ1 препараттарына жауап беруде маңызды. Олар сондай-ақ паклитакселдің CDK4/6 киназа/микротүтікше ингибиторы екенін және оның JQ1 сияқты BBDI-мен үйлесуі дәріге төзімді TNBC-ге перспективалы терапиялық жауаптар бере алатынын хабарлады (Ge және т.б., 2020).
Ұзын кодталмайтын РНҚ-ның (lncRNA) транскрипциялық ландшафты TNBC-де неоадъювантты терапияға төзімділікке жауапты екені туралы хабарланды. Бұл зерттеу бес түрлі MALAT1 lncRNA транскрипттерінің TNBC-де жоғары экспрессияланатынын көрсетеді. Сонымен қатар, MALAT1-дің CRISPR/Cas9 арқылы жойылуы TNBC BT-549 жасушаларының паклитаксел мен доксорубицинге сезімталдығын арттырды, бұл TNBC-де MALAT1 төзімділігінің әлеуетті рөлін көрсетеді (Shaath және т.б., 2021).
BRCA1 (BRCA1m) мутациялары гетерогенді және сондықтан анықтау қиын. BRCA1 синтетикалық өлімге әкелетін серіктесі PARP1 (поли(ADP-рибоза) полимераза) нысанаға алу TNBC препаратының хемосезімталдығын арттыруы мүмкін. CRISPR/Cas9 қолдану арқылы PARP1 делециясы доксорубицин, гемцитабин және доцетаксел сияқты қатерлі ісікке қарсы препараттардың mBRCA1 мутантты TNBC жасушаларына сезімталдығын арттырды, бұл PARP1-дің TNBC-дегі дәрілік төзімділікке де қатысатынын көрсетеді (Vaghari-Tabari және т.б., 2022). BRCA1 немесе BRCA2 ісік супрессор гендеріндегі мутациялар адамдарда сүт безі қатерлі ісігінің даму ықтималдығын арттыратыны белгілі. Бұл науқастарды емдеу PARP тежегіштерін қолдануды қажет етеді. Сонымен қатар, CRISPR/Cas9 көмегімен нуклеотидті қалпына келтіру факторы DNPH1-ді нокаутқа түсіру улы нуклеотидті 5-гидроксиметилдезоксиуридин (hmdU) монофосфатты кетіре алатыны, осылайша BRCA жетіспейтін жасушалардың PARP ингибиторларына сезімталдығын арттыратыны көрсетілген (Fugger). және т.б., 2021). Осылайша, CRISPR/Cas9 және PARP1 ингибиторлары TNBC үшін маңызды емдеу стратегиясына айналуы мүмкін.
Пенетрантты гликопротеин (P-gp) гені - бұл барлық TNBC-дің шамамен 41%-ында жоғары реттелетін көп дәрілік төзімділік гені (Sun және т.б., 2020). P-gp индукцияланған дәрілік ағын сүт безі қатерлі ісігіндегі дәрілік төзімділіктің негізгі реттегіші ретінде анықталды. P-gp ингибиторлары сүт безі қатерлі ісігіндегі қатерлі ісікке қарсы препараттарға сезімталдықтың жоғарылауын көрсетті (Famta және т.б., 2021). Осылайша, CRISPR/Cas9 арқылы P-gp және P-gp ингибиторларын абляциялау немесе басу TNBC-дегі дәрілік төзімділікті жеңудің өте маңызды әдістері болуы мүмкін.
АТФ-байланыстыратын кассеталық тасымалдаушы G2 (ABCG2) TNBC-де дәріге төзімділікті тудыратыны белгілі (Palasuberniam және т.б., 2015), дегенмен қазіргі уақытта CRISPR/Cas9 және ABCG2 үнсіздеуі мен ісік супрессоры генінің инактивациясы арасындағы байланыс туралы есептер жоқ. PTEN ABCG2 белсенділігін күшейтуі мүмкін (Palasuberniam және т.б., 2015), (Deepak Singh және т.б., 2021). Сондықтан, ABCG2-ні жою үшін CRISP/Ca9 қолдану және оны ABCG2 ингибиторымен біріктіру TNBC-де дәріге төзімділікті жеңу үшін қолайлы емдеу әдісі болуы мүмкін. 2-кестеде CRISPR/Cas9 барлық төзімділік гендеріне бағытталғаны айтылған.
2-кесте. CRISPR/Cas9 жасушаларды қатерлі ісікке қарсы препараттарға сезімтал ету үшін әртүрлі TNBC төзімділік гендеріне бағытталған.
CRISPR/Cas9 кітапханалары қатерлі ісік патогенезімен байланысты ген мутацияларын скринингтеудің әлеуетті құралдары болып табылады (Chan және т.б., 2022). Бұл скрининг әдісі (а) кітапхана құру, (b) лентивирустық трансдукция, (c) фенотиптік скрининг және (d) нысаналы генді талдау сияқты төрт кезеңді қамтиды. TNBC MAPK жолының қалыптан тыс белсенділігіне ие болса да, PTEN, RB1 және TP53 сияқты ісік супрессор гендерінде мутациялары бар TNBC пациенттері үшін MEK мақсатты терапиясының клиникалық болжамы өте нашар.
Сонымен қатар, CRISPR/Cas9 көмегімен гендік нокаут скринингі дегидрокатролдың MDA-MB-231-ге әсерін түсіну үшін Гватемала гүлдері мен жапырақ сығындыларында мол кездесетін ең күшті және селективті молекула дегидрокатролды тексерді. Селективті жасуша цитотоксикалық механизмдері. TNBC кіші түрлерінің мезенхималық бағаналық сипаттамалары. Бұл CRISPR/Cas9 негізіндегі скрининг сонымен қатар 17β-гидроксистероидты дегидрогеназа 11 типін кодтайтын HSD17B11 генінің MDA-MB-231 жасушаларында жоғары экспрессияланатынын және MDA-MB-231 жасушаларына тән дегидрофалькаринолға әкелетінін көрсетті (Grant және т.б., 2020). Осылайша, бұл CRISPR/Cas9 геномдық скринингінің әлеуетті табиғи қосылыстардың қатерлі ісікке қарсы қасиеттерінің негізінде жатқан механизмдерді анықтауда үлкен әлеуетке ие екенін көрсетеді.
Сонымен қатар, TNBC қатерлі ісікке осалдығы геном бойынша in vivo CRISPR/Cas9 скринингін қолдану арқылы зерттелді, бұл онкогендік және ісік супрессорлық жолдары арасындағы байланысты көрсетті. mTOR және Hippo жолдарының негізгі компоненттері TNBC ісіктерін реттеуде маңызды рөл атқаратыны туралы хабарланды. Сонымен қатар, зерттеулер mTORC1/2 және YAP онкопротеинінің фармакологиялық тежелуі in vitro дәрілік матрица синергия моделін және in vivo пациенттерден алынған ксенотрансплантаттарды қолдана отырып, TNBC патогенділігін тиімді түрде тежейтінін көрсетті. Сонымен қатар, Торин-1 арқылы mTORC1/2 тежелуі макропиноцитозды күшейтеді, ал вертепорфинмен индукцияланған YAP тежелуі TNBC жасушаларының өліміне әкеледі. Жалпы алғанда, бұл нәтижелер TNBC үшін жаңа және тиімді емдеу әдістерін анықтау үшін геном бойынша in vivo CRISPR скринингінің күші мен беріктігін көрсетеді (Dai және т.б., 2021).
Иммундық жүйенің реттелуінің бұзылуы ісіктің пайда болуының маңызды факторы болып табылады. Қатерлі ісік жасушалары қорғаныс механизмдерін айналып өту арқылы, соның ішінде ісік микроортасында иммундық жасушалардың белсенділігіне кедергі келтіру және иммундық жүйені бұзу арқылы иммундық тазартудан жалтарады. Сондықтан, жақсартылған иммундық жүйені дамыту ісіктермен күресудің негізгі тәсілі болуы мүмкін. CRISPR/Cas9 негізіндегі гендік модификацияны қолдану иммундық дисфункцияға қатысты бірнеше мәселелерді әртүрлі тұрғыдан қарастырады. CRISPR/Cas9 сүт безі қатерлі ісігіне қарсы ісікке қарсы иммунитетті келесі жолдар арқылы жақсарту үшін қолданылған (3-сурет).
3-сурет. CRISPR/Cas9 иммунотерапиясы TNBC жасушаларына бағытталған. CDK5 жоғалуы және PDL1 мен CD155 нокдаундары иммундық жүйені күшейтеді. Сол сияқты, A2AR жоғалуы және HER2, муцин 1 және TEM8 сияқты TAA нокдаундары CAR-T жасушаларының қатерлі ісік жасушаларын жоюдағы тиімділігін арттырды. CRISPR/Cas9 басқаратын Т жасушаларын скринингтеу p38 киназасының бұзылуы Т жасушаларының ісікке қарсы белсенділігін арттыратынын көрсетті. CRISPR/Cas9 модификациялаған Т жасушалары TCR (Т жасуша рецепторы) экспрессиясын арттырады, нәтижесінде Т жасушаларында ісікке қарсы белсенділік пайда болады.
Иммунотерапияның мақсаты - иммундық жүйені қатерлі ісік жасушаларына шабуыл жасауға ынталандыру. Иммундық бақылау нүктесі ақуыздарының шамадан тыс экспрессиясы әдетте аутоиммундық реакциялардың алдын алады, бірақ қатерлі ісіктердің алдын алуға көмектеседі (Topalian және т.б., 2015). Бұл ақуыздар иммундық жасушалардың бетіндегі рецепторлармен байланысу арқылы иммундық реакциялардың алдын алады. Бірнеше бақылау нүктесі ақуыздары (мысалы, CD155 және PD-L1) иммундық жасушалардағы PD-1 рецепторын нысанаға алады және сүт безі қатерлі ісігінде, әсіресе TNBC-де экспрессияланады (Li Y.-C. және т.б., 2020). CRISPR/Cas9 көмегімен PD-L1 немесе оның рецепторын нокауттау иммундық жүйені TNBC ісіктеріне шабуыл жасауға ынталандыруы мүмкін (Yahata және т.б., 2019). Сонымен қатар, CDK5-тің CRISPR/Cas9 арқылы жойылуы арқылы PD-L1 экспрессиясының төмендеуі in vitro және in vivo ісіктің өсуін тежейтіні көрсетілген (Deng және т.б., 2020). Сүт безі қатерлі ісігінің in vitro және in vivo модельдеріндегі өсудің тежелуі shRNA арқылы CD155-тің азаюының сүт безі қатерлі ісігіне терапиялық әсер етуі мүмкін екенін көрсетеді (Gao және т.б., 2018).
CAR T жасушалары ісікпен байланысты антигендерді (TAA) танитын және олардың белсенділігін арттыру үшін бақылау нүктелерінің ақуыздарын нокдаун арқылы пайдалана алатын CAR-ларды экспрессиялайды (Li C. және т.б., 2020). Сүт безі қатерлі ісігінде CAR T жасушаларын емдеудің әртүрлі әлеуетті нысаналары бар, соның ішінде HER2, mucin1 және TEM8 сияқты бірнеше TAA (Bajgain және т.б., 2018). Мезотелинге бағытталған CAR T жасушаларының (TNBC BT-459 жасушаларында шамадан тыс экспрессияланған) қатерлі ісікке қарсы PD-1 CRISPR/Cas9 көмегімен нокаутқа ұшыраған кезде тиімдірек екендігі туралы дәлелдер бар (Hu және т.б., 2019). Дегенмен, пациенттерден Т жасушаларын бөліп алу және оларды ex vivo редакциялау көп еңбекті және уақытты қажет ететін процесс. Әмбебап Т жасушалары оқшаулау талаптарын азайта алса да, трансплантатқа қарсы қожайын ауытқуларының алдын алу үшін адам лейкоциттерінің (HLA) I класының антигенін (HLA) және Т жасушаларының рецепторын (TCR) экспрессиялайтын донорлық Т жасушаларын алып тастау керек (Ren және т.б., 2017). , 2017a). CRISPR/Cas9 көмегімен HDR бір мезгілде TCR мен HLA-ны жоя алады және CAR кодтайтын генді жоя алады. Зерттеулер CRISPR/Cas9-ды TCR локусына анти-CD19 CAR енгізу үшін пайдалануға болатынын, осылайша Т жасушаларын әлсіретпей CAR-ларды тиімді түрде өндіруге болатынын көрсетті (Dimitri және т.б., 2022). TCR, бета-2-микроглобулин (B2M), HLA-I суббірлігін және PD-1 және CTLA-4 сияқты басқа ақуыздарды бір мезгілде жою арқылы аллогендік CAR T жасушаларын генерациялау үшін мультиплекс технологиялары жасалды, олардың қатерлі ісікке қарсы қасиеттері жоғары болуы мүмкін. TNBC-ге қарсы (Eyquem және т.б., 2017; Liu және т.б., 2017; Ren және т.б., 2017b; Dimitri және т.б., 2022).
CRISPR/Cas9 қолдану CAR-T жасушаларының тиімділігін арттыруы мүмкін. Аденозиннің иммуносупрессивті қасиеттері бар екені белгілі және Т-жасушаларының қызметін блоктау және аденозин A2A рецепторларын (A2AR) белсендіру арқылы қатерлі ісікке қарсы иммунитетті төмендете алады (Vigano және т.б., 2019). CRISPR/Cas9 қолдану арқылы A2AR-ды өшіру CAR-T жасушаларының in vivo тиімділігін айтарлықтай жақсартты (Giuffrida және т.б., 2021). Т-жасушалары жасушалық кеңею, дифференциация, тотығу стрессі және геномдық стресс сияқты әртүрлі фенотиптік сипаттамаларды көрсететіні белгілі. CRISPR/Cas9 негізіндегі Т-жасушаларын скринингтеу 25 түрлі Т-жасуша рецепторлық киназаның бұзылуын анықтады. Олардың ішінде p38 киназаның жойылуы Т-жасушаларының ісікке қарсы белсенділігін арттыратыны көрсетілген, бұл p38 киназаның CAR-T жасушаларының реттелуінің негізгі реттеушісі екенін көрсетеді (Gurusamy және т.б., 2020).
Т жасушаларын CRISPR/Cas9 көмегімен генетикалық түрлендіруге болады, бұл жоғары экспрессияланған TCR-лерді өндіруге мүмкіндік береді. Генетикалық түрлендірілген Т жасушаларын пациенттерге беру эндогендік Т жасушаларына қарағанда қатерлі ісікке қарсы белсенділіктің жоғары екенін көрсетті. Сондықтан, эндогендік TCR пациенттерде генетикалық түрлендірілген TCR-лермен бәсекелесуі мүмкін, бұл қатерлі ісік иммунотерапиясының әлеуетіне әсер етуі мүмкін. Бұл мәселені шешу үшін, реципиент жасушаларындағы эндогендік TCR-β-ны жою және кейіннен TCR-β Т жасушаларын қатерлі ісік науқастарына беру үшін CRISPR/Cas9 қолдану эндогендік TCR жыныстық бәсекелестігінсіз қатерлі ісікке қарсы иммундық реакцияларды жақсырақ көрсетуі мүмкін (Fan және т.б., 2018). Осылайша, CRISPR-модификацияланған Т жасушаларын қоспағанда, TCR-лер қалыпты TCR-трансдукцияланған Т жасушаларына қарағанда ісік антигендеріне мың есе сезімтал. Сонымен қатар, әртүрлі лейкемияларда γδ TCR+ CRISPR арқылы түзілген өзгертілген Т жасушалары стандартты TCR трансфертіне қарағанда CD4+ және CD8+ Т жасушаларының жоғары экспрессиясын көрсетеді (Legut және т.б., 2018). Осылайша, CRISPR/Cas9 арқылы жасалған модификацияланған Т жасушалары TNBC-ді жеңудің тиімді иммунотерапия әдісі болуы мүмкін.
Интегриндер - жасушалық трансмембранада болатын және жасушалардың жасушадан тыс матрицаға (ECM) байланысуын ынталандыратын жасуша адгезия молекулалары (Hamidi және Ivaska, 2018). Интегриндердің реттелуінің бұзылуы жасушадан тыс матрицаны өзгерту арқылы қатерлі ісіктің дамуымен және миграциясымен байланысты, бұл қан айналымындағы қатерлі ісік жасушаларының тіршілігіне әкеледі (Hamidi және Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9 арқылы интегриннің нокдауны TNBC-де ісіктің өршуін, метастазды және колонизацияны баяулатады. Интегрин a5 (ITGA5) нокдаунының өкпе рагы сияқты басқа қатерлі ісіктерде жасуша миграциясын және өршуін төмендететіні туралы хабарланған (Ju және т.б., 2017), бұл интегрин a5-тің TNBC патогенезіндегі негізгі фактор болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Дәстүрлі эмбриондық бағаналы жасуша (ЭС) әдістерін қолдана отырып, нокаут тышқандарын алу көп еңбекті қажет ететін, уақытты қажет ететін және тиімсіз процесс. ЭС жасушаларын гомологиялық рекомбинация арқылы нысанаға алу, химерлі тышқандарды өсіру, содан кейін оларды гетерозиготалы тышқандармен будандастыру және гомозиготалы ұрпақтарды алу үшін бірнеше айлар мен жылдар қажет. Бірнеше генетикалық мутациясы бар тышқандарды жасау үшін күрделі будандастыру қажет. Дегенмен, CRISPR/Cas9 көмегімен ЭС жасушаларын абляциялау немесе CRISPR/Cas9 компоненттерін бір жасушалы ұрықтандырылған жұмыртқа жасушаларына микроинъекциялау арқылы алынған тышқандарды пайдалану кезінде көптеген мәселелер туындады. Мысалы, өзгерістер көбінесе биаллельді локустарда болады және генге тән емес. Жақында CRISPR/Cas9 технологиясын қолдана отырып, ЭС жасушалары бір уақытта 5 генге дейін биаллельді мутацияларды енгізе алатыны туралы хабарланды (Нишизоно және т.б., 2021). Осы мақсатта Cas9 мРНҚ және бес генге тән гРНҚ бір уақытта ЭС жасушаларына трансфекцияланды. Бұл процедураның перспективасы мен тиімділігін көрсетеді, дегенмен бұл мутациялар бес еселенген нокаут тышқандарын алу үшін негізін қалаушы желілерді өсіру кезінде берілуі мүмкін. Зерттеуде сондай-ақ таңқаларлық жаңалық ашылды: генетикалық түрлендірілген тышқандарды жасау үшін ES жасушалары қажет емес. Оның орнына, белгілі бір ген өнімдерін жою үшін Cas9 мРНҚ және gRNA бір жасушалы сатыдағы эмбриондарға енгізілді. Нәтижесінде, тышқандардағы гендердің жойылуының салдарын зерттеу үшін теориялық тұрғыдан пайдалануға болатын нокаут негізін қалаушы желілер жасалды (Qin et al., 2016). Осылайша, CRISPR/Cas9 дәстүрлі гендік инженерияға қарағанда TNBC-ді емдеу үшін трансгенді тышқандарды жасауға мүмкіндік береді. CRISPR/Cas жүйесін пайдаланып, TNBC-дегі бір немесе бірнеше эндогенді гендерге нүктелік мутацияларды сәтті енгізе алатын жаңа нокаут тышқан моделі жасалды. Осы тұжырымдамаға сүйене отырып, TNBC жануарлар модельдерін CRISPR/Cas9 арқылы BRCA1 және p53 жою арқылы да жасауға болады, бұл HR қалпына келтірудің жоғалуына, геномдық тұрақсыздыққа және мутант фенотиптеріне әкеледі (Annunziato et al., 2020).
Қазіргі уақытта маммография, магнитті-резонанстық томография (МРТ) және ультрадыбыстық зерттеу сияқты әртүрлі әдістер сүт безі қатерлі ісігін диагностикалау үшін қолданылады. Дегенмен, бұл әдістердің кейбір шектеулері бар. Маммография қатерлі ісік жасушалары басқа мүшелерге көшкен метастаздарды емес, жергілікті сүт безі тінін диагностикалау үшін қолданылады. Ультрадыбыстық зерттеу сүт безі қатерлі ісігін диагностикалаудың сенімді әдісі емес (Chen and Lee-Felker, 2023). МРТ ультрадыбыстық және маммографияға қарағанда жоғары сезімталдыққа ие, бірақ оның диагностикалық дәлдігі шектеулі (Sha and Chen, 2022). Тін биопсиясы қатерлі ісік жасушаларын анықтаудың инвазивті әдісі болып табылады. Дегенмен, кейбір жағдайларда ине қызығушылық аймағынан ауытқып кетсе, биопсия қатерлі ісік тінін жіберіп алуы мүмкін. Сонымен қатар, бұл өте қымбат және науқас үшін жарақаттық болуы мүмкін. Сүт безі қатерлі ісігі - гетерогенді қатерлі ісік түрі, сондықтан биопсия қатерлі ісік түрі туралы жеткілікті ақпарат бермеуі мүмкін. Сондықтан, Сүт безі қатерлі ісігін анықтаудың жаңа диагностикалық сенімді әдісі шұғыл қажет. CRISPR/Cas9 сүт безі қатерлі ісігін диагностикалау үшін өте сезімтал және минималды инвазивті балама ретінде қызмет етуі мүмкін. Осы мақсатта CRISPR/Cas9 негізіндегі стратегияларды TNBC диагностикасы үшін ПТР әдістерін жақсарту үшін пайдалануға болады. Алдымен, CRISPR жүйесінің Cas9 және cpf1 ақуыздары спецификалық емес ДНҚ-ны жою үшін қолданылады, содан кейін бұл екі ақуыз (Cas9 және cpf1) мақсатты ДНҚ-ға байланыспас бұрын PAM тізбегін тани алады (Deepak Singh et al., 2021). Осылайша, ПТР қатерлі ісіктің дамуымен байланысты мутацияларды анықтай алады. Бірнеше зерттеулер әртүрлі қатерлі ісіктердегі әртүрлі мутацияларды анықтау үшін осы CRISPR негізіндегі стратегияны қабылдады (Safari et al., 2019). Осылайша, CRISPR негізіндегі ПТР әдістері TNBC диагнозының биопсияға негізделген иммуногистохимия сияқты инвазивті әдістерге тәуелділігін азайтуы мүмкін.
Гормон рецепторларының реттелуіндегі генотиптік өзгерістер TNBC-де де көрсетілген (Chen және Russo, 2009). Емдеу орнында диагностикалау үшін микрочиптерді пайдаланатын CRISPR/Cas9 негізіндегі ПТР стратегиялары бұл мутацияларды тиімді бақылай алады (Hajian және т.б., 2019). Сондай-ақ, ол денсаулық сақтау қызметкерлеріне TNBC пациенттеріндегі нақты мутациялар туралы тиісті ақпарат бере алады, бұл олардың емдеу курсын жақсартуға көмектеседі. Дегенмен, бұл біріктірілген әдістің шектеулері бар. Сондықтан, CRISPR/Cas-PCR әдісін TNBC диагностикасы үшін денсаулық сақтауда қолданар алдында кең көлемді зерттеу жұмыстары қажет (Yang және т.б., 2019).
Жарияланған уақыты: 2024 жылғы 14 қазан