Компьютерлік томография (КТ) арқылы анықталған өкпе түйіндерінің дифференциалды диагнозы клиникалық тәжірибеде қиындық тудыруда. Мұнда біз сау бақылау тобын, қатерсіз өкпе түйіндерін және I сатыдағы өкпе аденокарциномасын қоса алғанда, 480 сарысу үлгілерінің жаһандық метаболомын сипаттаймыз. Аденокарциномалар бірегей метаболомиялық профильдерді көрсетеді, ал қатерсіз түйіндер мен сау адамдар метаболомиялық профильдерде жоғары ұқсастыққа ие. Ашу тобында (n = 306) қатерсіз және қатерлі түйіндерді ажырату үшін 27 метаболит жиынтығы анықталды. Ішкі валидация (n = 104) және сыртқы валидация (n = 111) топтарындағы дискриминант моделінің AUC сәйкесінше 0,915 және 0,945 болды. Жолды талдау қатерсіз түйіндер мен сау бақылау тобымен салыстырғанда өкпе аденокарциномасының сарысуындағы триптофанның төмендеуімен байланысты гликолитикалық метаболиттердің көбеюін анықтады және триптофанның сіңуі өкпе қатерлі ісігі жасушаларында гликолизді күшейтетінін көрсетті. Біздің зерттеуіміз КТ арқылы анықталған өкпе түйіндерінің қаупін бағалауда сарысу метаболиттерінің биомаркерлерінің маңыздылығын көрсетеді.
Қатерлі ісікпен ауыратын науқастардың өмір сүру деңгейін жақсарту үшін ерте диагностика өте маңызды. АҚШ-тың Ұлттық өкпе обырын скринингтік сынағының (NLST) және Еуропалық NELSON зерттеуінің нәтижелері төмен дозалы компьютерлік томографиямен (LDCT) скрининг жүргізу жоғары қауіп топтарында өкпе обырынан болатын өлім-жітімді айтарлықтай төмендете алатынын көрсетті1,2,3. LDCT өкпе обырын скринингтеу үшін кеңінен қолданылғаннан бері, симптомсыз өкпе түйіндерінің кездейсоқ рентгенологиялық анықталу жиілігі артып келеді4. Өкпе түйіндері диаметрі 3 см-ге дейінгі ошақты бұлыңғырлық ретінде анықталады5. Біз қатерлі ісік ықтималдығын бағалауда және LDCT кезінде кездейсоқ анықталған өкпе түйіндерінің көп санымен күресуде қиындықтарға тап боламыз. КТ шектеулері жиі бақылау тексерулеріне және жалған оң нәтижелерге әкелуі мүмкін, бұл қажетсіз араласуға және шамадан тыс емдеуге әкеледі6. Сондықтан, өкпе обырын ерте сатыларда дұрыс анықтау және бастапқы анықтау кезінде көптеген қатерсіз түйіндерді ажырату үшін сенімді және пайдалы биомаркерлерді әзірлеу қажет7.
Қанның (сарысу, плазма, перифериялық қанның мононуклеарлы жасушалары) кешенді молекулалық талдауы, оның ішінде геномика, протеомика немесе ДНҚ метилденуі8,9,10, өкпе обырының диагностикалық биомаркерлерін ашуға деген қызығушылықтың артуына әкелді. Сонымен қатар, метаболомика тәсілдері эндогендік және экзогендік әрекеттердің әсерінен болатын жасушалық соңғы өнімдерді өлшейді және сондықтан аурудың басталуы мен нәтижесін болжау үшін қолданылады. Сұйық хроматография-тандемдік масс-спектрометрия (LC-MS) жоғары сезімталдығы мен үлкен динамикалық диапазонына байланысты метаболомиканы зерттеу үшін кеңінен қолданылатын әдіс болып табылады, ол әртүрлі физика-химиялық қасиеттері бар метаболиттерді қамтуы мүмкін11,12,13. Плазманың/сарысуының жаһандық метаболомиялық талдауы өкпе обырын диагностикалаумен байланысты биомаркерлерді анықтау үшін қолданылғанымен14,15,16,17 және емдеу тиімділігімен байланысты18, өкпенің қатерсіз және қатерлі түйіндерін ажырату үшін сарысу метаболиттерінің жіктеуіштері әлі де көп зерттелуі керек. - ауқымды зерттеулер.
Аденокарцинома және жалпақ жасушалы карцинома - ұсақ жасушалы емес өкпе обырының (ҰЖОО) екі негізгі кіші түрі. Әртүрлі КТ скринингтік сынақтары аденокарциноманың өкпе обырының ең көп таралған гистологиялық түрі екенін көрсетеді1,19,20,21. Бұл зерттеуде біз сау бақылау тобын, қатерсіз өкпе түйіндерін және КТ арқылы анықталған ≤3 см-ді қоса алғанда, барлығы 695 сарысу үлгісінде метаболомикалық талдау жүргізу үшін ультра өнімді сұйық хроматография-жоғары ажыратымдылықтағы масс-спектрометрияны (UPLC-HRMS) қолдандық. I сатыдағы өкпе аденокарциномасын скринингтеу. Біз өкпе аденокарциномасын қатерсіз түйіндерден және сау бақылау тобынан ажырататын сарысу метаболиттерінің панелін анықтадық. Жолды байыту талдауы триптофан мен глюкоза метаболизмінің ауытқуы қатерсіз түйіндер мен сау бақылау тобымен салыстырғанда өкпе аденокарциномасында жиі кездесетін өзгерістер екенін көрсетті. Соңында, біз ерте дифференциалды диагноз қоюға және қауіпті бағалауға көмектесетін LDCT арқылы анықталған қатерлі және қатерсіз өкпе түйіндерін ажырату үшін жоғары ерекшелігі мен сезімталдығы бар сарысу метаболикалық жіктеуішін құрдық және тексердік.
Ағымдағы зерттеуде жынысы мен жасы бойынша сәйкес келетін сарысу үлгілері 174 сау бақылау тобынан, қатерсіз өкпе түйіндері бар 292 науқастан және I сатыдағы өкпе аденокарциномасы бар 229 науқастан ретроспективті түрде жиналды. 695 субъектінің демографиялық сипаттамалары 1-қосымша кестеде көрсетілген.
1a суретте көрсетілгендей, Сунь Ятсен университетінің онкологиялық орталығында 174 сау бақылау (HC), 170 қатерсіз түйін (BN) және 136 I сатыдағы өкпе аденокарциномасының (LA) үлгілерін қоса алғанда, барлығы 480 сарысу үлгісі жиналды. Ультра өнімді сұйықтық хроматографиясы-жоғары ажыратымдылықтағы масс-спектрометрия (UPLC-HRMS) көмегімен мақсатты емес метаболомиялық профильдеуге арналған ашылу когорты. 1-қосымша суретте көрсетілгендей, жіктеу моделін құру және дифференциалды жолды талдауды одан әрі зерттеу үшін LA мен HC, LA және BN арасындағы дифференциалды метаболиттер анықталды. Сунь Ятсен университетінің онкологиялық орталығы жинаған 104 үлгі және басқа екі аурухана жинаған 111 үлгі сәйкесінше ішкі және сыртқы валидациядан өтті.
a Ультра өнімді сұйықтық хроматографиясы-жоғары ажыратымдылықтағы масс-спектрометрия (UPLC-HRMS) көмегімен жаһандық сарысу метаболомикалық талдауынан өткен ашылу когортасындағы зерттеу популяциясы. b Зерттеу когортасынан алынған 480 сарысу үлгісінің жалпы метаболомының ішінара ең кіші квадраттар дискриминант талдауы (PLS-DA), соның ішінде сау бақылау тобы (HC, n = 174), қатерсіз түйіндер (BN, n = 170) және I сатыдағы өкпе аденокарциномасы (Лос-Анджелес, n = 136). +ESI, оң электроспрей иондау режимі, -ESI, теріс электроспрей иондау режимі. c–e Екі берілген топта айтарлықтай әртүрлі мөлшердегі метаболиттер (екі жақты Уилкоксон таңбалы ранг сынағы, жалған ашылу жылдамдығының түзетілген p мәні, FDR <0,05) қызыл (қабат өзгерісі > 1,2) және көк (қабат өзгерісі <0,83) түстермен көрсетілген. ) жанартау графигінде көрсетілген. f LA және BN арасындағы аннотацияланған метаболиттер санындағы айтарлықтай айырмашылықтарды көрсететін иерархиялық кластерлік жылу картасы. Бастапқы деректер бастапқы деректер файлдары түрінде берілген.
Ашу тобындағы 174 HC, 170 BN және 136 LA жалпы сарысу метаболомы UPLC-HRMS талдауын қолдану арқылы талданды. Алдымен біз сапаны бақылау (QC) үлгілерінің бақылаусыз негізгі компонентті талдау (PCA) моделінің орталығында тығыз шоғырланғанын көрсетеміз, бұл ағымдағы зерттеудің өнімділігінің тұрақтылығын растайды (2-қосымша сурет).
1b суретіндегі ішінара ең кіші квадраттар дискриминант талдауында (PLS-DA) көрсетілгендей, оң (+ESI) және теріс (−ESI) электроспрей ионизация режимдерінде LA мен BN, LA мен HC арасында айқын айырмашылықтар бар екенін анықтадық. Дегенмен, +ESI және -ESI жағдайларында BN мен HC арасында айтарлықтай айырмашылықтар табылған жоқ.
Біз LA мен HC арасында 382 дифференциалды белгіні, LA мен BN арасында 231 дифференциалды белгіні және BN мен HC арасында 95 дифференциалды белгіні таптық (Уилкоксонның қол қойылған ранг сынағы, FDR <0,05 және көптік өзгеріс >1,2 немесе <0,83) (.1c-e сурет). . Шыңдар m/z мәні, сақтау уақыты және фрагментациялық масса спектрін іздеу (әдістер бөлімінде сипатталған) бойынша дерекқорға (mzCloud/HMDB/Chemspider кітапханасы) қарсы қосымша аннотацияланды (Қосымша деректер 3). Соңында, LA мен BN (1f сурет және 2-қосымша кесте) және LA мен HC (3-қосымша сурет және 2-қосымша кесте) үшін молдығында айтарлықтай айырмашылықтары бар 33 және 38 аннотацияланған метаболиттер сәйкесінше анықталды. Керісінше, BN мен HC-де молдығында айтарлықтай айырмашылықтары бар тек 3 метаболит анықталды (2-қосымша кесте), бұл PLS-DA-дағы BN мен HC арасындағы сәйкестікке сәйкес келеді. Бұл дифференциалды метаболиттер биохимиялық заттардың кең ауқымын қамтиды (4-қосымша сурет). Жалпы алғанда, бұл нәтижелер ерте сатыдағы өкпе обырының қатерлі трансформациясын көрсететін сарысу метаболомасында айтарлықтай өзгерістерді көрсетеді, бұл қатерсіз өкпе түйіндерімен немесе сау адамдармен салыстырғанда. Сонымен қатар, BN және HC сарысу метаболомының ұқсастығы қатерсіз өкпе түйіндерінің сау адамдармен көптеген биологиялық сипаттамалары болуы мүмкін екенін көрсетеді. Эпидермальды өсу факторы рецепторы (EGFR) генінің мутациялары өкпе аденокарциномасының 23-ші кіші типінде жиі кездесетінін ескере отырып, біз драйвер мутацияларының сарысу метаболомына әсерін анықтауға тырыстық. Содан кейін біз өкпе аденокарциномасы тобындағы EGFR мәртебесі бар 72 жағдайдың жалпы метаболомиялық профилін талдадық. Қызықтысы, біз PCA талдауында EGFR мутанттары бар науқастар (n = 41) және EGFR жабайы типті науқастар (n = 31) арасында салыстырмалы профильдерді таптық (5a-қосымша сурет). Дегенмен, біз EGFR мутациясы бар науқастарда жабайы типті EGFR бар науқастармен салыстырғанда айтарлықтай өзгерген 7 метаболитті анықтадық (t тесті, p < 0,05 және қатпарлану өзгерісі > 1,2 немесе < 0,83) (қосымша 5b сурет). Бұл метаболиттердің көпшілігі (7-ден 5-і) май қышқылдарының тотығу жолдарында маңызды рөл атқаратын ацилкарнитиндер болып табылады.
2a суретте көрсетілген жұмыс процесінде көрсетілгендей, түйіндерді жіктеуге арналған биомаркерлер ең аз абсолютті кішірею операторларын және LA (n = 136) және BN (n = 170) анықталған 33 дифференциалды метаболиттерге негізделген таңдауды пайдаланып алынды. Айнымалылардың ең жақсы комбинациясы (LASSO) – екілік логистикалық регрессия моделі. Модельдің сенімділігін тексеру үшін он еселенген айқаспалы валидация қолданылды. Айнымалыларды таңдау және параметрлерді реттеу λ24 параметрімен ықтималдықты максификациялау айыппұлымен реттеледі. Дискриминант моделінің жіктеу өнімділігін тексеру үшін жаһандық метаболомика талдауы ішкі валидация (n = 104) және сыртқы валидация (n = 111) топтарында тәуелсіз жүргізілді. Нәтижесінде, ашылу жиынындағы 27 метаболит ең үлкен орташа AUC мәні бар ең жақсы дискриминант моделі ретінде анықталды (2b-сурет), олардың ішінде 9-ы BN-мен салыстырғанда LA-да белсенділікті арттырды және 18-і төмендеді (2c-сурет).
Өкпе түйінінің жіктеуішін құруға арналған жұмыс процесі, оның ішінде он еселі айқаспалы валидация арқылы екілік логистикалық регрессия моделін пайдаланып, ашылу жиынындағы сарысу метаболиттерінің ең жақсы панелін таңдау және ішкі және сыртқы валидация жиынтықтарындағы болжамды өнімділікті бағалау. b Метаболикалық биомаркерді таңдау үшін LASSO регрессия моделінің айқаспалы валидация статистикасы. Жоғарыда келтірілген сандар берілген λ кезінде таңдалған биомаркерлердің орташа санын білдіреді. Қызыл нүктелі сызық сәйкес лямбдадағы орташа AUC мәнін білдіреді. Сұр қателік жолақтары минималды және максималды AUC мәндерін білдіреді. Нүктелі сызық 27 таңдалған биомаркері бар ең жақсы модельді көрсетеді. AUC, қабылдағыштың жұмыс сипаттамасы (ROC) қисығының астындағы аудан. c LA тобындағы 27 таңдалған метаболиттің ашылу тобындағы BN тобымен салыстырғандағы өзгерістері. Қызыл баған – белсендіру. Көк баған – төмендеу. d–f Ашу, ішкі және сыртқы валидация жиынтықтарындағы 27 метаболит комбинациясына негізделген дискриминант моделінің қуатын көрсететін қабылдағыштың жұмыс сипаттамасы (ROC) қисықтары. Бастапқы деректер бастапқы деректер файлдары түрінде ұсынылады.
Осы 27 метаболиттің өлшенген регрессия коэффициенттеріне негізделген болжам моделі жасалды (3-қосымша кесте). Осы 27 метаболитке негізделген ROC талдауы қисық астындағы ауданды (AUC) 0,933 мәніне, ашу тобының сезімталдығына 0,868 және ерекшелігіне 0,859 мәнге жеткізді (2d-сурет). Сонымен қатар, LA мен HC арасындағы 38 аннотацияланған дифференциалды метаболиттердің ішінде 16 метаболит жиынтығы LA-ны HC-ден ажыратуда 0,801 сезімталдығымен және 0,856 ерекшелігімен 0,902 AUC-ке жетті (6a-c қосымша сурет). Дифференциалды метаболиттер үшін әртүрлі қатпарлану өзгерісінің табалдырықтарына негізделген AUC мәндері де салыстырылды. Біз жіктеу моделінің қатпарлану өзгерісінің деңгейі 1,2-ге қарсы 1,5 немесе 2,0-ге орнатылған кезде LA мен BN (HC) арасындағы айырмашылықты анықтауда ең жақсы нәтиже көрсеткенін анықтадық (7a,b қосымша сурет). 27 метаболит тобына негізделген жіктеу моделі ішкі және сыртқы когорталарда одан әрі тексерілді. AUC ішкі валидация үшін 0,915 (сезімталдық 0,867, ерекшелік 0,811) және сыртқы валидация үшін 0,945 (сезімталдық 0,810, ерекшелік 0,979) болды (2e, f-сурет). Зертханааралық тиімділікті бағалау үшін сыртқы когортадан алынған 40 үлгі «Әдістер» бөлімінде сипатталғандай сыртқы зертханада талданды. Жіктеу дәлдігі AUC 0,925-ке жетті (қосымша 8-сурет). Өкпенің жалпақ жасушалы карциномасы (LUSC) өкпе аденокарциномасынан (LUAD) кейінгі екінші ең көп таралған кіші түрі болғандықтан, біз метаболикалық профильдердің тексерілген әлеуетті пайдалылығын да тексердік. BN және LUSC-ның 16 жағдайы. LUSC және BN арасындағы ажырату AUC 0,776 болды (қосымша 9-сурет), бұл LUAD және BN арасындағы ажыратумен салыстырғанда нашар қабілетті көрсетеді.
Зерттеулер КТ суреттеріндегі түйіндердің мөлшері қатерлі ісіктің пайда болу ықтималдығымен оң корреляцияланғанын және түйіндерді емдеудің негізгі факторы болып қала беретінін көрсетті25,26,27. NELSON скринингтік зерттеуінің үлкен когортасынан алынған деректерді талдау түйіндері <5 мм болатын субъектілерде қатерлі ісік қаупі тіпті түйіндері жоқ субъектілердегіге ұқсас екенін көрсетті28. Сондықтан, тұрақты КТ мониторингін қажет ететін ең аз өлшем Британдық кеуде қоғамы (BTS) ұсынғандай 5 мм және Флейшнер қоғамы ұсынғандай 6 мм29. Дегенмен, 6 мм-ден үлкен және айқын қатерсіз белгілері жоқ, анықталмаған өкпе түйіндері (IPN) деп аталатын түйіндер клиникалық тәжірибеде бағалау мен басқаруда үлкен қиындық болып қала береді30,31. Келесіде біз ашылу және ішкі валидация когорталарынан алынған біріктірілген үлгілерді пайдаланып, түйін өлшемінің метаболомиялық қолтаңбаларға әсер ететін-етпейтінін зерттедік. 27 валидацияланған биомаркерлерге назар аудара отырып, біз алдымен HC және BN суб-6 мм метаболомдарының PCA профильдерін салыстырдық. Біз HC және BN деректерінің көпшілігінің қабаттасқанын анықтадық, бұл екі топта да сарысу метаболиттерінің деңгейлерінің ұқсас екенін көрсетті (3a-сурет). Әртүрлі өлшем диапазондарындағы ерекшелік карталары BN және LA-да сақталған (3b, c-сурет), ал 6-20 мм диапазонында қатерлі және қатерсіз түйіндер арасында айырмашылық байқалды (3d-сурет). Бұл когортаның AUC 0,927, спецификалығы 0,868 және 6-дан 20 мм-ге дейінгі түйіндердің қатерлі ісігін болжау үшін сезімталдығы 0,820 болды (3e, f-сурет). Біздің нәтижелеріміз жіктеуіштің түйіннің өлшеміне қарамастан, ерте қатерлі трансформациядан туындаған метаболикалық өзгерістерді анықтай алатынын көрсетеді.
ad 27 метаболиттің метаболикалық жіктеуішіне негізделген көрсетілген топтар арасындағы PCA профильдерін салыстыру. CC және BN < 6 мм. b BN < 6 мм vs BN 6–20 мм. LA 6–20 мм-де LA 20–30 мм-ге қарсы. g BN 6–20 мм және LA 6–20 мм. GC, n = 174; BN < 6 мм, n = 153; BN 6–20 мм, n = 91; LA 6–20 мм, n = 89; LA 20–30 мм, n = 77. e 6–20 мм түйіндер үшін дискриминантты модельдің өнімділігін көрсететін қабылдағыштың жұмыс сипаттамасының (ROC) қисығы. f Ықтималдық мәндері 6–20 мм өлшемді түйіндер үшін логистикалық регрессия моделіне негізделген. Сұр нүктелі сызық оңтайлы шекті мәнді (0,455) білдіреді. Жоғарыдағы сандар Лос-Анджелес үшін болжанған жағдайлардың пайызын білдіреді. Екі жақты Стьюденттің t-тестін пайдаланыңыз. PCA, негізгі компонентті талдау. Қисық астындағы AUC ауданы. Бастапқы деректер бастапқы деректер файлдары түрінде беріледі.
Ұсынылған қатерлі ісік болжау моделінің жұмысын көрсету үшін өкпе түйіндерінің өлшемдері ұқсас (7-9 мм) төрт үлгі (44-61 жас) таңдалды (4a, b сурет). Бастапқы скрининг кезінде 1-жағдай кальцийленуі бар қатты түйін ретінде көрінді, бұл қатерсіз ісікпен байланысты белгі, ал 2-жағдай айқын қатерсіз белгілері жоқ анықталмаған жартылай қатты түйін ретінде көрінді. Үш кезеңнен кейінгі КТ сканерлеу бұл жағдайлардың 4 жыл ішінде тұрақты болып қалғанын және сондықтан қатерсіз түйіндер болып саналатынын көрсетті (4a сурет). Сериялық КТ сканерлеулерінің клиникалық бағалауымен салыстырғанда, ағымдағы жіктеуіш моделімен бір реттік сарысу метаболиттерін талдау бұл қатерсіз түйіндерді ықтималдық шектеулерге негізделген тез және дұрыс анықтады (1-кесте). 3-жағдайдағы 4b суретте көбінесе қатерлі ісікпен байланысты плевраның кері тартылу белгілері бар түйін көрсетілген32. 4-жағдай қатерсіз себебінің дәлелі жоқ анықталмаған жартылай қатты түйін ретінде көрінді. Барлық осы жағдайлар жіктеуіш моделіне сәйкес қатерлі деп болжанған (1-кесте). Өкпе аденокарциномасын бағалау өкпе резекциясы операциясынан кейін гистопатологиялық зерттеу арқылы көрсетілген (4b-сурет). Сыртқы валидация жиынтығы үшін метаболикалық жіктеуіш 6 мм-ден үлкен анықталмаған өкпе түйіндерінің екі жағдайын дәл болжады (10-қосымша сурет).
Қатерсіз түйіндердің екі жағдайындағы өкпенің осьтік терезесінің КТ суреттері. 1-жағдайда, 4 жылдан кейінгі КТ зерттеуі оң жақ төменгі бөлікте кальцификациясы бар 7 мм өлшемді тұрақты қатты түйінді көрсетті. 2-жағдайда, 5 жылдан кейінгі КТ зерттеуі оң жақ жоғарғы бөлікте диаметрі 7 мм болатын тұрақты, жартылай қатты түйінді анықтады. b Өкпенің осьтік терезе КТ суреттері және өкпе резекциясына дейінгі I сатыдағы аденокарциноманың екі жағдайының тиісті патологиялық зерттеулері. 3-жағдайда оң жақ жоғарғы бөлікте плевра ретракциясы бар диаметрі 8 мм болатын түйін анықталды. 4-жағдайда сол жақ жоғарғы бөлікте 9 мм өлшемді жартылай қатты жер шыны түйіні анықталды. Резекцияланған өкпе тінінің гематоксилин және эозин (H&E) бояуы (масштабты жолақ = 50 мкм) өкпе аденокарциномасының ацинарлық өсу үлгісін көрсетеді. Көрсеткілер КТ суреттерінде анықталған түйіндерді көрсетеді. H&E кескіндері - патологоанатом зерттеген бірнеше (>3) микроскопиялық өрістердің репрезентативті кескіндері.
Жалпы алғанда, біздің нәтижелеріміз өкпе түйіндерінің дифференциалды диагностикасында сарысу метаболиттерінің биомаркерлерінің әлеуетті құндылығын көрсетеді, бұл КТ скринингін бағалау кезінде қиындықтар тудыруы мүмкін.
Расталған дифференциалды метаболит панеліне сүйене отырып, біз негізгі метаболикалық өзгерістердің биологиялық корреляцияларын анықтауға тырыстық. MetaboAnalyst жүргізген KEGG жолын байыту талдауы екі берілген топ арасында 6 жалпы айтарлықтай өзгерген жолды анықтады (LA vs. HC және LA vs. BN, түзетілген p ≤ 0,001, әсер > 0,01). Бұл өзгерістер пируват метаболизмінің, триптофан метаболизмінің, ниацин мен никотинамид метаболизмінің, гликолиздің, TCA циклінің және пурин метаболизмінің бұзылуымен сипатталды (5a-сурет). Содан кейін біз абсолютті сандық бағалауды қолдана отырып, негізгі өзгерістерді тексеру үшін мақсатты метаболомиканы жүргіздік. Жалпы өзгерген жолдардағы жалпы метаболиттерді түпнұсқа метаболит стандарттарын қолдана отырып, үштік квадрупольдік масс-спектрометрия (QQQ) арқылы анықтау. Метаболомиканы зерттеу нысанасының демографиялық сипаттамалары 4-қосымша кестеде келтірілген. Біздің жаһандық метаболомика нәтижелерімізге сәйкес, сандық талдау гипоксантин мен ксантиннің, пируваттың және лактаттың LA-да BN және HC-мен салыстырғанда жоғарылағанын растады (5b, c, p <0,05 сурет). Дегенмен, BN мен HC арасында бұл метаболиттерде айтарлықтай айырмашылықтар табылған жоқ.
LA тобындағы BN және HC топтарымен салыстырғанда айтарлықтай ерекшеленетін метаболиттердің KEGG жолын байыту талдауы. Екі жақты Globaltest қолданылды және p мәндері Holm-Bonferroni әдісін қолдана отырып түзетілді (түзетілген p ≤ 0,001 және әсер мөлшері > 0,01). b–d LC-MS/MS арқылы анықталған сарысудағы HC, BN және LA-дағы гипоксантин, ксантин, лактат, пируват және триптофан деңгейлерін көрсететін скрипка графиктері (топ үшін n = 70). Ақ және қара нүктелі сызықтар медиана мен квартильді сәйкесінше көрсетеді. e LUAD-TCGA деректер жинағындағы қалыпты өкпе тінімен (n = 59) салыстырғанда өкпе аденокарциномасындағы SLC7A5 және QPRT-тің қалыпқа келтірілген Log2TPM (миллионға транскрипттер) мРНҚ экспрессиясын (n = 513) көрсететін скрипка графикі. Ақ қорап квартильаралық диапазонды, ортасындағы көлденең қара сызық медиананы, ал қораптан созылған тік қара сызық 95% сенімділік аралығын (СІ) білдіреді. f TCGA деректер жинағындағы өкпе аденокарциномасындағы (n = 513) және қалыпты өкпе тініндегі (n = 59) SLC7A5 және GAPDH экспрессиясының Пирсон корреляциялық графигі. Сұр аймақ 95% СІ-ді білдіреді. r, Пирсон корреляциялық коэффициенті. g LC-MS/MS арқылы анықталған спецификалық емес shRNA бақылауымен (NC) және shSLC7A5 (Sh1, Sh2) трансфекцияланған A549 жасушаларындағы қалыпқа келтірілген жасушалық триптофан деңгейлері. Әр топтағы бес биологиялық тәуелсіз үлгінің статистикалық талдауы ұсынылған. h A549 жасушаларындағы (NC) және SLC7A5 нокдаун A549 жасушаларындағы (Sh1, Sh2) NADt жасушалық деңгейлері (жалпы NAD, соның ішінде NAD+ және NADH). Әр топтағы үш биологиялық тәуелсіз үлгінің статистикалық талдауы ұсынылған. i SLC7A5 нокдаунына дейінгі және кейінгі A549 жасушаларының гликолитикалық белсенділігі жасушадан тыс қышқылдану жылдамдығы (ECAR) арқылы өлшенді (топта n = 4 биологиялық тәуелсіз үлгі). 2-DG, 2-дезокси-D-глюкоза. (b–h) бөлімінде екі жақты Стьюдент t сынағы қолданылды. (g–i) бөлімінде қателік жолақтары орташа ± SD мәнін білдіреді, әрбір тәжірибе үш рет тәуелсіз орындалды және нәтижелері ұқсас болды. Бастапқы деректер бастапқы деректер файлдары түрінде берілген.
LA тобындағы триптофан метаболизмінің өзгеруінің айтарлықтай әсерін ескере отырып, біз QQQ көмегімен HC, BN және LA топтарындағы сарысу триптофан деңгейін де бағаладық. Біз LA-да сарысу триптофанының HC немесе BN-мен салыстырғанда төмендегенін анықтадық (p < 0,001, 5d-сурет), бұл өкпе обыры бар науқастарда айналымдағы триптофан деңгейінің бақылау тобындағы сау бақылау тобына қарағанда төмен екендігі туралы бұрынғы зерттеулермен сәйкес келеді33,34,35. ПЭТ/КТ индикаторы 11C-метил-L-триптофанды қолданатын тағы бір зерттеу өкпе обыры тініндегі триптофан сигналын сақтау уақыты қатерсіз зақымданулармен немесе қалыпты тіндермен салыстырғанда айтарлықтай артқанын анықтады36. Біз LA сарысуындағы триптофанның төмендеуі өкпе обыры жасушаларының триптофанды белсенді түрде сіңіруін көрсетуі мүмкін деп болжаймыз.
Триптофан катаболизмінің кинуренин жолының соңғы өнімі NAD+37,38 екені де белгілі, ол глицеральдегид-3-фосфаттың гликолизде 1,3-бисфосфоглицератпен реакциясы үшін маңызды субстрат болып табылады39. Алдыңғы зерттеулер триптофан катаболизмінің иммундық реттеудегі рөліне бағытталған болса, біз ағымдағы зерттеуде байқалған триптофанның дисрегуляциясы мен гликолитикалық жолдар арасындағы өзара әрекеттесуді анықтауға тырыстық. Еріген зат тасымалдаушыларының 7-мүшесі 5 (SLC7A5) триптофан тасымалдаушысы екені белгілі43,44,45. Хинолин қышқылының фосфорибозилтрансферазасы (QPRT) - кинуренин жолының төменгі жағында орналасқан, хинолин қышқылын NAMN46-ға айналдыратын фермент. LUAD TCGA деректер жиынтығын тексеру SLC7A5 және QPRT екеуі де ісік тінінде қалыпты тіндермен салыстырғанда айтарлықтай жоғарылағанын көрсетті (5e сурет). Бұл өсім өкпе аденокарциномасының I және II сатыларында, сондай-ақ III және IV сатыларында байқалды (қосымша 11-сурет), бұл ісіктің пайда болуымен байланысты триптофан алмасуының ерте бұзылыстарын көрсетеді.
Сонымен қатар, LUAD-TCGA деректер жиынтығы қатерлі ісікпен ауыратын науқастардың үлгілеріндегі SLC7A5 және GAPDH мРНҚ экспрессиясы арасында оң корреляцияны көрсетті (r = 0,45, p = 1,55E-26, 5f-сурет). Керісінше, қалыпты өкпе тініндегі мұндай гендік белгілер арасында айтарлықтай корреляция табылған жоқ (r = 0,25, p = 0,06, 5f-сурет). A549 жасушаларындағы SLC7A5 (қосымша 12-сурет) нокдауны жасушалық триптофан мен NAD(H) деңгейін айтарлықтай төмендетті (5g,h-сурет), нәтижесінде жасушадан тыс қышқылдану жылдамдығымен (ECAR) өлшенгендей гликолитикалық белсенділіктің әлсіреуіне әкелді (1-сурет). 5i). Осылайша, сарысудағы және in vitro анықтаудағы метаболикалық өзгерістерге сүйене отырып, біз триптофан метаболизмі кинуренин жолы арқылы NAD+ түзуі және өкпе қатерлі ісігінде гликолизді ілгерілетуде маңызды рөл атқаруы мүмкін деген болжам жасаймыз.
Зерттеулер көрсеткендей, LDCT арқылы анықталған анықталмаған өкпе түйіндерінің көп мөлшері қатерлі ісіктің жалған оң диагнозына байланысты ПЭТ-КТ, өкпе биопсиясы және шамадан тыс емдеу сияқты қосымша тексерулер қажеттілігіне әкелуі мүмкін.31 6-суретте көрсетілгендей, біздің зерттеуіміз КТ арқылы анықталған өкпе түйіндерінің қауіп стратификациясын және кейінгі басқаруын жақсартуы мүмкін ықтимал диагностикалық құндылығы бар сарысу метаболиттерінің панелін анықтады.
Өкпе түйіндері қатерсіз немесе қатерлі себептерді көрсететін бейнелеу ерекшеліктері бар төмен дозалы компьютерлік томография (ТДКТ) көмегімен бағаланады. Түйіндердің белгісіз нәтижесі жиі бақылауға, қажетсіз араласуларға және шамадан тыс емдеуге әкелуі мүмкін. Диагностикалық құндылығы бар сарысу метаболикалық жіктеуіштерін қосу өкпе түйіндерін қауіпті бағалауды және кейіннен басқаруды жақсартуы мүмкін. ПЭТ позитронды-эмиссиялық томография.
АҚШ NLST зерттеуі мен еуропалық NELSON зерттеуінің деректері жоғары қауіпті топтарды төмен дозалы компьютерлік томографиямен (LDCT) скринингтеу өкпе қатерлі ісігінен болатын өлім-жітімді азайтуы мүмкін екенін көрсетеді1,3. Дегенмен, LDCT арқылы анықталған кездейсоқ өкпе түйіндерінің көп мөлшерін қауіпті бағалау және кейіннен клиникалық басқару ең қиын мәселе болып қала береді. Негізгі мақсат - сенімді биомаркерлерді енгізу арқылы LDCT негізіндегі қолданыстағы хаттамаларды дұрыс жіктеуді оңтайландыру.
Қан метаболиттері сияқты белгілі бір молекулалық биомаркерлер өкпе обырын сау бақылау тобымен салыстыру арқылы анықталды15,17. Ағымдағы зерттеуде біз LDCT арқылы кездейсоқ анықталған қатерсіз және қатерлі өкпе түйіндерін ажырату үшін сарысу метаболомикасын талдауды қолдануға назар аудардық. Біз UPLC-HRMS талдауын қолдана отырып, сау бақылау (HC), қатерсіз өкпе түйіндері (BN) және I сатыдағы өкпе аденокарциномасы (LA) үлгілерінің жаһандық сарысу метаболомын салыстырдық. Біз HC және BN метаболикалық профильдері ұқсас екенін, ал LA HC және BN-мен салыстырғанда айтарлықтай өзгерістер көрсеткенін анықтадық. Біз LA-ны HC және BN-ден ажырататын сарысу метаболиттерінің екі жиынтығын анықтадық.
Қатерсіз және қатерлі түйіндерді анықтаудың қазіргі LDCT негізіндегі схемасы негізінен уақыт өте келе түйіндердің мөлшеріне, тығыздығына, морфологиясына және өсу жылдамдығына негізделген30. Алдыңғы зерттеулер түйіндердің мөлшері өкпе қатерлі ісігінің ықтималдығымен тығыз байланысты екенін көрсетті. Тіпті жоғары қауіпті науқастарда да <6 мм түйіндердегі қатерлі ісік қаупі <1% құрайды. 6-дан 20 мм-ге дейінгі түйіндердегі қатерлі ісік қаупі 8%-дан 64%-ға дейін30. Сондықтан Флейшнер қоғамы күнделікті КТ бақылауы үшін 6 мм кесу диаметрін ұсынады.29 Дегенмен, 6 мм-ден үлкен анықталмаған өкпе түйіндерінің (IPN) қаупін бағалау және басқару жеткілікті түрде жүргізілмеген31. Туа біткен жүрек ауруын қазіргі емдеу әдетте жиі КТ бақылауымен мұқият күтуге негізделген.
Тексерілген метаболомға сүйене отырып, біз алғаш рет сау адамдар мен қатерсіз түйіндер арасындағы метаболомиялық белгілердің қабаттасуын көрсеттік <6 мм. Биологиялық ұқсастық бұрынғы КТ зерттеулерімен сәйкес келеді, бұл түйіндерсіз субъектілердегідей қатерлі ісік қаупі төмен.30 Біздің нәтижелеріміз сонымен қатар <6 мм және ≥6 мм қатерсіз түйіндердің метаболомиялық профильдерінде жоғары ұқсастыққа ие екенін көрсетеді, бұл қатерсіз этиологияның функционалдық анықтамасы түйіннің өлшеміне қарамастан тұрақты екенін көрсетеді. Осылайша, заманауи диагностикалық сарысу метаболиттері панельдері КТ-да түйіндер алғаш анықталған кезде бір ғана талдауды болдырмау сынағы ретінде ұсынуы мүмкін және сериялық мониторингті азайтуы мүмкін. Сонымен қатар, метаболикалық биомаркерлердің сол панелі өлшемі ≥6 мм қатерлі түйіндерді қатерсіз түйіндерден ажыратып, ұқсас өлшемдегі IPN және КТ суреттеріндегі анық емес морфологиялық белгілер үшін дәл болжамдар берді. Бұл сарысу метаболизмінің жіктеушісі ≥6 мм түйіндердің қатерлі ісігін AUC 0,927 кезінде жақсы болжады. Жалпы алғанда, біздің нәтижелеріміз сарысудағы метаболикалық белгілердің бірегейлігі ісік тудыратын ерте метаболикалық өзгерістерді нақты көрсетуі мүмкін екенін және түйіннің өлшеміне тәуелсіз қауіп предикторлары ретінде әлеуетті құндылыққа ие болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Атап айтқанда, өкпе аденокарциномасы (LUAD) және жалпақ жасушалы карцинома (LUSC) ұсақ жасушалы емес өкпе обырының (NSCLC) негізгі түрлері болып табылады. LUSC темекі шегумен тығыз байланысты екенін47 және LUAD компьютерлік томографияда анықталған кездейсоқ өкпе түйіндерінің ең көп таралған гистологиясы екенін48 ескере отырып, біздің жіктеуіш моделіміз I сатыдағы аденокарцинома үлгілері үшін арнайы жасалған. Ван және әріптестері сонымен қатар LUAD-қа назар аударып, ерте сатыдағы өкпе обырын сау адамдардан ажырату үшін липидомиканы қолдана отырып, тоғыз липидтік қолтаңбаны анықтады17. Біз ағымдағы жіктеуіш моделін I сатыдағы LUSC және 74 қатерсіз түйіндердің 16 жағдайында тексеріп, LUSC болжау дәлдігінің төмендігін (AUC 0,776) байқадық, бұл LUAD пен LUSC-тің өзіндік метаболикалық қолтаңбалары болуы мүмкін екенін көрсетеді. Шынында да, LUAD пен LUSC этиологиясы, биологиялық шығу тегі және генетикалық ауытқулары бойынша ерекшеленетіні көрсетілген49. Сондықтан, скринингтік бағдарламаларда өкпе обырын популяцияға негізделген анықтауға арналған оқыту модельдеріне гистологияның басқа түрлерін қосу керек.
Мұнда біз сау бақылау тобымен және қатерсіз түйіндермен салыстырғанда өкпе аденокарциномасында ең жиі өзгеретін алты жолды анықтадық. Ксантин мен гипоксантин - пурин метаболизмі жолының кең таралған метаболиттері. Біздің нәтижелерімізге сәйкес, пурин метаболизмімен байланысты аралық өнімдер сау бақылау тобымен немесе инвазивті кезеңдегі пациенттермен салыстырғанда өкпе аденокарциномасы бар пациенттердің сарысуында немесе тіндерінде айтарлықтай жоғарылаған15,50. Сарысудағы ксантин мен гипоксантин деңгейінің жоғарылауы қатерлі ісік жасушаларының тез көбеюіне қажетті анаболизмді көрсетуі мүмкін. Глюкоза метаболизмінің бұзылуы қатерлі ісік метаболизмінің белгілі белгісі болып табылады51. Мұнда біз HC және BN тобымен салыстырғанда LA тобында пируват пен лактаттың айтарлықтай өсуін байқадық, бұл ұсақ жасушалы емес өкпе обыры (NSCLC) пациенттері мен сау бақылау тобының сарысу метаболомы профильдеріндегі гликолитикалық жол ауытқулары туралы бұрынғы есептерге сәйкес келеді. Нәтижелер біркелкі52,53.
Маңыздысы, біз өкпе аденокарциномаларының сарысуындағы пируват пен триптофан метаболизмі арасында кері корреляцияны байқадық. LA тобында сарысу триптофанының деңгейі HC немесе BN тобымен салыстырғанда төмендеді. Қызығы, проспективті когортты қолдана отырып жүргізілген алдыңғы ауқымды зерттеу айналымдағы триптофанның төмен деңгейі өкпе қатерлі ісігінің қаупінің жоғарылауымен байланысты екенін анықтады 54. Триптофан - біз толығымен тамақтан алатын маңызды аминқышқылы. Біз өкпе аденокарциномасындағы сарысу триптофанының азаюы осы метаболиттің тез азаюын көрсетуі мүмкін деген қорытындыға келдік. Кинуренин жолы арқылы триптофан катаболизмінің соңғы өнімі de novo NAD+ синтезінің көзі болып табылатыны белгілі. NAD+ негізінен құтқару жолы арқылы өндірілетіндіктен, денсаулық пен ауру кезінде триптофан метаболизміндегі NAD+ маңыздылығы әлі анықталмаған46. TCGA дерекқорын талдауымыз триптофан тасымалдаушысының еріген зат тасымалдаушысы 7A5 (SLC7A5) экспрессиясының қалыпты бақылау тобымен салыстырғанда өкпе аденокарциномасында айтарлықтай жоғарылағанын және гликолитикалық фермент GAPDH экспрессиясымен оң корреляцияланғанын көрсетті. Алдыңғы зерттеулер негізінен триптофан катаболизмінің ісікке қарсы иммундық жауапты басудағы рөліне бағытталған40,41,42. Мұнда біз өкпе обыры жасушаларында SLC7A5 нокдаунымен триптофанның сіңуін тежеу жасушалық NAD деңгейінің төмендеуіне және гликолитикалық белсенділіктің бір мезгілде төмендеуіне әкелетінін көрсетеміз. Қорытындылай келе, біздің зерттеуіміз өкпе аденокарциномасының қатерлі трансформациясымен байланысты сарысу метаболизмінің өзгерістеріне биологиялық негіз береді.
EGFR мутациялары NSCLC бар науқастарда ең көп таралған қозғаушы мутациялар болып табылады. Біздің зерттеуімізде EGFR мутациясы бар науқастардың (n = 41) жалпы метаболикалық профильдері жабайы типті EGFR (n = 31) бар науқастарға ұқсас екенін анықтадық, дегенмен ацилкарнитинмен ауыратын науқастарда кейбір EGFR мутанттары бар науқастардың сарысу деңгейінің төмендегенін анықтадық. Ацилкарнитиндердің белгіленген қызметі - ацил топтарын цитоплазмадан митохондриялық матрицаға тасымалдау, бұл май қышқылдарының тотығуына әкеліп, энергия өндіруге әкеледі 55. Біздің зерттеуімізге сәйкес, жақында жүргізілген зерттеу 102 өкпе аденокарциномасы тінінің үлгілерінің жаһандық метаболомын талдау арқылы EGFR мутанты мен EGFR жабайы типті ісіктер арасындағы ұқсас метаболомдық профильдерді анықтады50. Қызықтысы, ацилкарнитин мөлшері EGFR мутанттары тобында да табылды. Сондықтан, ацилкарнитин деңгейінің өзгеруі EGFR тудырған метаболикалық өзгерістерді және негізгі молекулалық жолдарды көрсететіні қосымша зерттеуді қажет етуі мүмкін.
Қорытындылай келе, біздің зерттеуіміз өкпе түйіндерінің дифференциалды диагностикасы үшін сарысу метаболикалық жіктеуішін белгілейді және КТ скринингіне негізделген қауіпті бағалауды оңтайландыратын және клиникалық басқаруды жеңілдететін жұмыс процесін ұсынады.
Бұл зерттеуді Сунь Ятсен университетінің онкологиялық ауруханасының этика комитеті, Сунь Ятсен университетінің бірінші филиал ауруханасы және Чжэнчжоу университетінің онкологиялық ауруханасының этика комитеті мақұлдады. Ашу және ішкі валидация топтарында Сунь Ятсен университетінің онкологиялық орталығының онкологиялық бақылау және алдын алу бөлімінде жыл сайынғы медициналық тексеруден өтетін адамдардан сау адамдардан 174 сарысу және қатерсіз түйіндерден 244 сарысу және Сунь Ятсен университетінің онкологиялық орталығынан 166 қатерсіз түйін жиналды. I сатыдағы өкпе аденокарциномалары Сунь Ятсен университетінің онкологиялық орталығынан жиналды. Сыртқы валидация когортасында Сунь Ятсен университетінің бірінші филиал ауруханасынан қатерсіз түйіндердің 48 жағдайы, I сатыдағы өкпе аденокарциномасының 39 жағдайы және Чжэнчжоу онкологиялық ауруханасынан I сатыдағы өкпе аденокарциномасының 24 жағдайы болды. Сунь Ятсен университетінің онкологиялық орталығы белгіленген метаболикалық жіктеуіштің диагностикалық қабілетін тексеру үшін I сатыдағы жалпақ жасушалы өкпе обырының 16 жағдайын жинады (пациенттердің сипаттамалары 5-қосымша кестеде көрсетілген). Ашу когортасынан және ішкі валидация когортасынан үлгілер 2018 жылдың қаңтары мен 2020 жылдың мамыры аралығында жиналды. Сыртқы валидация когортасына арналған үлгілер 2021 жылдың тамызы мен 2022 жылдың қазаны аралығында жиналды. Жыныстық кемсітушілікті азайту үшін әр когортаға шамамен тең мөлшерде ерлер мен әйелдер жағдайлары тағайындалды. Ашу тобы және ішкі шолу тобы. Қатысушылардың жынысы өзін-өзі бағалау негізінде анықталды. Барлық қатысушылардан хабардар келісім алынды және ешқандай өтемақы берілмеді. Қатерсіз түйіндері бар субъектілер талдау кезінде 2-ден 5 жылға дейін тұрақты КТ көрсеткіші бар адамдар болды, операция алдында жиналған және гистопатология арқылы диагноз қойылған сыртқы валидация үлгісінен 1 жағдайды қоспағанда. Созылмалы бронхитті қоспағанда. Өкпе аденокарциномасы жағдайлары өкпе резекциясы алдында жиналды және патологиялық диагнозбен расталды. Аш қарынға қан үлгілері ешқандай антикоагулянттарсыз сарысуды бөлу түтіктерінде жиналды. Қан үлгілері бөлме температурасында 1 сағат бойы ұйытылды, содан кейін сарысу үстіңгі қабатын жинау үшін 2851 × g кезінде 4°C температурада 10 минут бойы центрифугаланды. Сарысу аликвоталары метаболиттер алынғанша -80°C температурада мұздатылды. Сунь Ятсен университетінің онкологиялық орталығының қатерлі ісіктің алдын алу және медициналық тексеру бөлімі 40-тан 55 жасқа дейінгі ерлер мен әйелдердің тең санын қоса алғанда, 100 сау донордан сарысу пулын жинады. Әрбір донор үлгісінің тең көлемі араластырылды, алынған пул аликвотацияланды және -80°C температурада сақталды. Сарысу қоспасы сапаны бақылау және деректерді стандарттау үшін анықтамалық материал ретінде пайдаланылды.
Анықтамалық сарысу мен сынақ үлгілері ерітіліп, метаболиттер аралас экстракция әдісімен (MTBE/метанол/су) алынды 56. Қысқаша айтқанда, 50 мкл сарысу 225 мкл мұздай метанолмен және 750 мкл мұздай метилтрет-бутил эфирімен (MTBE) араластырылды. Қоспаны араластырып, мұзда 1 сағат бойы инкубациялаңыз. Содан кейін үлгілер араластырылып, Cambridge Isotope Laboratories компаниясынан сатып алынған ішкі стандарттар (13C-лактат, 13C3-пируват, 13C-метионин және 13C6-изолейцин) бар 188 мкл MS-дәрежелі сумен араластырылды. Содан кейін қоспа 4°C температурада 10 минут бойы 15 000 × g температурада центрифугаланды, ал төменгі фаза оң және теріс режимдерде LC-MS талдауы үшін екі түтікке (әрқайсысы 125 мкл) ауыстырылды. Соңында, үлгі жоғары жылдамдықты вакуумдық концентраторда кепкенше буландырылды.
Кептірілген метаболиттер 120 мкл 80% ацетонитрилде қалпына келтірілді, 5 минут бойы араластырылды және 4°C температурада 10 минут бойы 15 000 × g жылдамдықпен центрифугаланды. Супернатанттар метаболомиканы зерттеу үшін микроқондырмалары бар кәріптас шыны құтыларға ауыстырылды. Ультра өнімді сұйық хроматография-жоғары ажыратымдылықтағы масс-спектрометрия (UPLC-HRMS) платформасында мақсатсыз метаболомика талдауы. Метаболиттер Dionex Ultimate 3000 UPLC жүйесі және ACQUITY BEH амид бағанасы (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters) арқылы бөлінді. Оң иондық режимде жылжымалы фазалар 95% (A) және 50% ацетонитрил (B) болды, олардың әрқайсысында 10 ммоль/л аммоний ацетаты және 0,1% құмырсқа қышқылы болды. Теріс режимде A және B жылжымалы фазаларында сәйкесінше 95% және 50% ацетонитрил болды, екі фазада да 10 ммоль/л аммоний ацетаты болды, рН = 9. Градиент бағдарламасы келесідей болды: 0–0,5 мин, 2% B; 0,5–12 мин, 2–50% B; 12–14 мин, 50–98% B; 14–16 мин, 98% B; 16–16,1 мин, 98–2% B; 16,1–20 мин, 2% B. Автоүлгі алу құрылғысында баған 40°C температурада, ал үлгі 10°C температурада ұсталды. Ағын жылдамдығы 0,3 мл/мин, инъекция көлемі 3 мкл болды. Электропроприцирленген ионизация (ESI) көзі бар Q-Exactive Orbitrap масс-спектрометрі (Thermo Fisher Scientific) толық сканерлеу режимінде жұмыс істеді және үлкен көлемдегі деректерді жинау үшін ddMS2 бақылау режимімен біріктірілді. MS параметрлері келесідей орнатылды: шашыратқыш кернеу +3,8 кВ/- 3,2 кВ, капиллярлық температура 320°C, қорғаныш газы 40 арб, көмекші газ 10 арб, зонд қыздырғышының температурасы 350°C, сканерлеу диапазоны 70–1050 м/сағ, ажыратымдылық 70 000. Деректер Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) көмегімен алынды.
Деректер сапасын бағалау үшін әрбір үлгіден 10 мкл супернатант аликвотасын алу арқылы біріктірілген сапаны бақылау (СБ) үлгілері жасалды. UPLC-MS жүйесінің тұрақтылығын бағалау үшін аналитикалық тізбектің басында алты сапаны бақылау үлгісінің инъекциясы талданды. Содан кейін сапаны бақылау үлгілері партияға мезгіл-мезгіл енгізіліп отырады. Бұл зерттеудегі сарысу үлгілерінің барлық 11 партиясы LC-MS арқылы талданды. Экстракция процесін бақылау және партиядан партияға әсерді реттеу үшін 100 сау донордан алынған сарысу пулы қоспасының аликвоталары тиісті партияларда анықтамалық материал ретінде пайдаланылды. Сунь Ятсен университетінің Метаболомика орталығында ашылу когортасының, ішкі валидация когортасының және сыртқы валидация когортасының мақсатты емес метаболомикалық талдауы жүргізілді. Гуандун технологиялық университетінің талдау және сынау орталығының сыртқы зертханасы да жіктеуіш моделінің өнімділігін тексеру үшін сыртқы когортадан 40 үлгіні талдады.
Экстракциядан және қалпына келтіруден кейін сарысу метаболиттерінің абсолютті сандық анықталуы көп реакциялық мониторинг (MRM) режимінде электроспрей ионизациясы (ESI) көзі бар ультра жоғары өнімді сұйық хроматография-тандемдік масс-спектрометрия (Agilent 6495 үштік квадруполь) көмегімен өлшенді. Метаболиттерді бөлу үшін ACQUITY BEH амид бағанасы (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Уотерс) пайдаланылды. Жылжымалы фаза 10 ммоль/л аммоний ацетаты және 0,1% аммиак ерітіндісі бар 90% (A) және 5% ацетонитрилден (B) тұрды. Градиенттік бағдарлама келесідей болды: 0–1,5 мин, 0% B; 1,5–6,5 мин, 0–15% B; 6,5–8 мин, 15% B; 8–8,5 мин, 15%-0% B; 8,5–11,5 мин, 0%B. Автоүлгілеушіде бағана 40 °C, ал үлгі 10 °C температурада ұсталды. Ағын жылдамдығы 0,3 мл/мин, ал инъекция көлемі 1 мкл болды. MS параметрлері келесідей орнатылды: капиллярлық кернеу ±3,5 кВ, небулайзер қысымы 35 psi, қабық газының ағыны 12 л/мин, қабық газының температурасы 350°C, кептіру газының температурасы 250°C және кептіру газының ағыны 14 л/мин. Триптофан, пируват, лактат, гипоксантин және ксантиннің MRM түрлендірулері сәйкесінше 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 және 151,0–107,9 болды. Деректер Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) көмегімен жиналды. Сарысу үлгілері үшін триптофан, пируват, лактат, гипоксантин және ксантин стандартты қоспа ерітінділерінің калибрлеу қисықтарын пайдаланып сандық анықталды. Жасуша үлгілері үшін триптофан мөлшері ішкі стандартқа және жасуша ақуыз массасына қалыпқа келтірілді.
Шыңның экстракциясы (м/з және сақтау уақыты (RT)) Compound Discovery 3.1 және TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) көмегімен жүргізілді. Партиялар арасындағы ықтимал айырмашылықтарды жою үшін, салыстырмалы молшылықты алу үшін сынақ үлгісінің әрбір сипаттамалық шыңы сол партиядан алынған анықтамалық материалдың сипаттамалық шыңына бөлінді. Стандарттауға дейінгі және кейінгі ішкі стандарттардың салыстырмалы стандартты ауытқулары 6-қосымша кестеде көрсетілген. Екі топ арасындағы айырмашылықтар жалған ашылу жылдамдығымен (FDR <0.05, Уилкоксонның қол қойылған ранг сынағы) және қатпарлану өзгерісімен (>1.2 немесе <0.83) сипатталды. Алынған ерекшеліктердің шикі MS деректері және анықтамалық сарысумен түзетілген MS деректері сәйкесінше 1-қосымша деректерде және 2-қосымша деректерде көрсетілген. Шыңның аннотациясы анықталған метаболиттер, болжамды аннотацияланған қосылыстар, болжамды сипатталған қосылыс кластары және белгісіз қосылыстарды қоса алғанда, төрт анықталған сәйкестендіру деңгейіне негізделіп жүргізілді 22. Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) дерекқорындағы іздеулерге сүйене отырып, дифференциалды метаболом арасындағы аралық өнімдер ретінде MS/MS сәйкес келетін валидацияланған стандарттары бар немесе mzCloud (ұпай > 85) немесе Chemspider-дегі дәл сәйкестік аннотациялары бар биологиялық қосылыстар ақырында таңдалды. Әрбір ерекшелік үшін ең жоғары аннотациялар Қосымша деректер 3-ке енгізілген. MetaboAnalyst 5.0 қосынды нормаланған метаболиттердің көптігін бір айнымалы талдау үшін пайдаланылды. MetaboAnalyst 5.0 сонымен қатар айтарлықтай әртүрлі метаболиттерге негізделген KEGG жолын байыту талдауын бағалады. Негізгі компоненттік талдау (PCA) және ішінара ең кіші квадраттар дискриминант талдауы (PLS-DA) стек нормалау және автомасштабтау арқылы ropls бағдарламалық пакетін (v.1.26.4) пайдаланып талданды. Түйіннің қатерлі ісігін болжаудың оңтайлы метаболит биомаркер моделі ең аз абсолютті кішіреюі бар екілік логистикалық регрессия және таңдау операторы (LASSO, R пакеті v.4.1-3) арқылы жасалды. Дискриминант моделінің анықтау және валидация жиынтықтарындағы өнімділігі pROC пакетіне (v.1.18.0.) сәйкес ROC талдауына негізделген AUC бағалау арқылы сипатталды. Оңтайлы ықтималдық шегі модельдің максималды Юден индексіне (сезімталдық + ерекшелік – 1) негізделіп алынды. Шекті мәннен аз немесе жоғары мәндері бар үлгілер сәйкесінше қатерсіз түйіндер және өкпе аденокарциномасы ретінде болжанады.
A549 жасушалары (#CCL-185, Американдық типті дақылдар жинағы) 10% FBS бар F-12K ортасында өсірілді. SLC7A5 нысанасына бағытталған қысқа шашты РНҚ (shRNA) тізбектері және нысаналанбайтын бақылау (NC) pLKO.1-puro лентивирустық векторына енгізілді. shSLC7A5 антисенс тізбектері келесідей: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5-ке (#5347) және тубулинге (#2148) антиденелер Cell Signaling Technology компаниясынан сатып алынды. SLC7A5 және тубулинге антиденелер Western blot талдауы үшін 1:1000 сұйылту кезінде пайдаланылды.
Seahorse XF гликолитикалық стресс-тест жасушадан тыс қышқылдану (ECAR) деңгейін өлшейді. Талдау кезінде ECAR арқылы өлшенген жасушалық гликолитикалық қабілетті тексеру үшін глюкоза, олигомицин А және 2-DG кезекпен енгізілді.
Нысанаға бағытталмаған бақылау (NC) және shSLC7A5 (Sh1, Sh2) трансфекцияланған A549 жасушалары диаметрі 10 см ыдыстарға түні бойы салынды. Жасуша метаболиттері 1 мл мұздай суық 80% сулы метанолмен экстракцияланды. Метанол ерітіндісіндегі жасушалар қырылып алынып, жаңа түтікке жиналып, 15 000 × g жылдамдықпен 4°C температурада 15 минут центрифугаланды. 800 мкл супернатант жинап, жоғары жылдамдықты вакуумдық концентраторды пайдаланып кептіріңіз. Содан кейін кептірілген метаболит түйіршіктері жоғарыда сипатталғандай LC-MS/MS көмегімен триптофан деңгейіне талданды. A549 жасушаларындағы (NC және shSLC7A5) жасушалық NAD(H) деңгейлері өндірушінің нұсқауларына сәйкес сандық NAD+/NADH колориметриялық жинағын (#K337, BioVision) пайдаланып өлшенді. Метаболиттердің мөлшерін қалыпқа келтіру үшін әрбір үлгі үшін ақуыз деңгейі өлшенді.
Үлгі мөлшерін алдын ала анықтау үшін статистикалық әдістер қолданылмады. Биомаркерлерді ашуға бағытталған бұрынғы метаболомика зерттеулері15,18 өлшемді анықтаудың эталондары ретінде қарастырылды және осы есептермен салыстырғанда біздің үлгіміз жеткілікті болды. Зерттеу когортасынан ешқандай үлгі алынып тасталмады. Сарысу үлгілері мақсатты емес метаболомика зерттеулері үшін кездейсоқ түрде ашылу тобына (306 жағдай, 74,6%) және ішкі валидация тобына (104 жағдай, 25,4%) тағайындалды. Сондай-ақ, біз мақсатты метаболомика зерттеулері үшін ашылу жиынтығынан әр топтан кездейсоқ түрде 70 жағдайды таңдадық. Зерттеушілерге LC-MS деректерін жинау және талдау кезінде топтық тағайындау мүмкіндігі берілмеді. Метаболомика деректері мен жасушалық эксперименттердің статистикалық талдаулары тиісті Нәтижелер, Сурет Аңыздары және Әдістер бөлімдерінде сипатталған. Жасушалық триптофан, NADT және гликолитикалық белсенділікті сандық бағалау бірдей нәтижелермен үш рет тәуелсіз жүргізілді.
Зерттеу дизайны туралы қосымша ақпарат алу үшін осы мақаламен байланысты Табиғи портфолио есебінің аннотациясын қараңыз.
Алынған белгілердің шикі MS деректері және анықтамалық сарысудың қалыпқа келтірілген MS деректері сәйкесінше 1-қосымша деректерде және 2-қосымша деректерде көрсетілген. Дифференциалды белгілердің шыңдық аннотациялары 3-қосымша деректерде келтірілген. LUAD TCGA деректер жиынтығын https://portal.gdc.cancer.gov/ сайтынан жүктеп алуға болады. Графикті салуға арналған кіріс деректері бастапқы деректерде берілген. Бастапқы деректер осы мақала үшін берілген.
Ұлттық өкпе скринингін зерттеу тобы және т.б. Төмен дозалы компьютерлік томография арқылы өкпе обырынан болатын өлімді азайту. Солтүстік Англия. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR және Prophet, PC Төмен дозалы спиральды КТ көмегімен өкпе обырын скринингтеу: Ұлттық өкпе скринингін зерттеу (NLST) нәтижелері. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, Х.Дж. және т.б. Рандомизацияланған сынақта көлемді КТ скринингі арқылы өкпе қатерлі ісігінен болатын өлімді азайту. Солтүстік Англия. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Жарияланған уақыты: 18 қыркүйек 2023 ж.