Компьютерлік томография (КТ) арқылы анықталған өкпе түйіндерінің дифференциалды диагностикасы клиникалық тәжірибеде күрделі мәселе болып қала береді.Мұнда біз 480 сарысу үлгілерінің жаһандық метаболомын сипаттаймыз, оның ішінде сау бақылаулар, жақсы өкпе түйіндері және I сатыдағы өкпе аденокарциномасы.Аденокарциномалар бірегей метаболомиялық профильдерді көрсетеді, ал қатерсіз түйіндер мен сау адамдар метаболомиялық профильдерде жоғары ұқсастыққа ие.Ашылған топта (n = 306) қатерсіз және қатерлі түйіндерді ажырату үшін 27 метаболиттер жиынтығы анықталды.Ішкі валидация (n = 104) және сыртқы валидация (n = 111) топтарындағы дискриминант үлгісінің AUC сәйкесінше 0,915 және 0,945 болды.Жолды талдау қатерсіз түйіндермен және сау бақылаулармен салыстырғанда өкпе аденокарциномасының сарысуындағы триптофанның төмендеуімен байланысты гликолитикалық метаболиттердің жоғарылауын анықтады және триптофанды қабылдау өкпе ісігі жасушаларында гликолизге ықпал етеді деп болжайды.Біздің зерттеуіміз КТ арқылы анықталған өкпе түйіндерінің қаупін бағалаудағы сарысу метаболитінің биомаркерлерінің құндылығын көрсетеді.
Ерте диагноз онкологиялық науқастардың өмір сүру деңгейін жақсарту үшін өте маңызды.АҚШ-тың Ұлттық өкпе обырын скринингтік сынағының (NLST) және Еуропалық NELSON зерттеуінің нәтижелері төмен дозалы компьютерлік томография (LDCT) көмегімен скринингтің жоғары тәуекел топтарындағы өкпе ісігінен өлім-жітімді айтарлықтай төмендетуі мүмкін екенін көрсетті1,2,3.Өкпенің қатерлі ісігінің скринингі үшін LDCT кеңінен қолданылғаннан бері, симптомсыз өкпе түйіндерінің кездейсоқ рентгенографиялық көріністерінің жиілігі артты 4 .Өкпе түйіндері диаметрі 5 3 см-ге дейін ошақты бұлыңғырлық ретінде анықталады.Біз қатерлі ісіктің ықтималдығын бағалауда және LDCT кезінде кездейсоқ анықталған өкпе түйіндерінің көп санымен күресуде қиындықтарға тап боламыз.КТ шектеулері жиі қайталанатын тексерулерге және жалған оң нәтижелерге әкелуі мүмкін, бұл қажетсіз араласуға және шамадан тыс емдеуге әкеледі6.Сондықтан, ерте кезеңдерінде өкпе обырын дұрыс анықтау және бастапқы анықтау кезінде қатерсіз түйіндердің көпшілігін саралау үшін сенімді және пайдалы биомаркерлерді әзірлеу қажет 7 .
Геномика, протеомика немесе ДНҚ метилденуі8,9,10 қоса алғанда, қанның (сарысу, плазма, перифериялық қанның мононуклеарлы жасушалары) жан-жақты молекулярлық талдауы өкпе ісігінің диагностикалық биомаркерлерін ашуға қызығушылықтың артуына әкелді.Сонымен қатар, метаболомика тәсілдер эндогендік және экзогендік әрекеттер әсер ететін жасушалық соңғы өнімдерді өлшейді, сондықтан аурудың басталуы мен нәтижесін болжау үшін қолданылады.Сұйық хроматография-тандемдік масс-спектрометрия (LC-MS) жоғары сезімталдығы мен үлкен динамикалық диапазонының арқасында метаболомиканы зерттеу үшін кеңінен қолданылатын әдіс болып табылады, ол әртүрлі физикалық-химиялық қасиеттері бар метаболиттерді қамтуы мүмкін11,12,13.Плазма/сарысудың жаһандық метаболомикалық талдауы өкпе обыры диагностикасымен байланысты биомаркерлерді анықтау үшін пайдаланылғанымен14,15,16,17 және емдеу тиімділігі18, өкпенің қатерсіз және қатерлі түйіндерін ажырату үшін сарысу метаболитінің жіктеуіштері әлі де көп зерттелуді қажет етеді.- ауқымды зерттеулер.
Аденокарцинома және скамозды жасушалық карцинома ұсақ жасушалы емес өкпе ісігінің (NSCLC) екі негізгі кіші түрі болып табылады.Түрлі КТ скринингтік сынақтары аденокарциноманың өкпе ісігінің ең көп таралған гистологиялық түрі екенін көрсетеді1,19,20,21.Бұл зерттеуде біз сау бақылауларды, жақсы өкпе түйіндерін және CT-анықталған ≤3 см-ді қоса алғанда, жалпы 695 сарысу үлгілеріне метаболомика талдауын жүргізу үшін ультра өнімді сұйық хроматография-жоғары ажыратымдылықтағы масс-спектрометрияны (UPLC-HRMS) қолдандық.Өкпе аденокарциномасының І сатысына скрининг.Біз өкпе аденокарциномасын қатерсіз түйіндерден және сау бақылаулардан ажырататын сарысу метаболиттерінің панелін анықтадық.Жолды байыту талдауы қалыпты емес триптофан мен глюкоза метаболизмі қатерсіз түйіндермен және сау бақылаулармен салыстырғанда өкпе аденокарциномасында жиі кездесетін өзгерістер болып табылатынын көрсетті.Соңында, біз LDCT арқылы анықталған қатерлі және қатерсіз өкпе түйіндерін ажырату үшін жоғары спецификасы мен сезімталдығы бар сарысу метаболизмінің жіктеуішін құрдық және растадық, бұл ерте дифференциалды диагностикаға және тәуекелді бағалауға көмектеседі.
Ағымдағы зерттеуде жынысы мен жасына сәйкес сарысу үлгілері ретроспективті түрде 174 сау бақылаушылардан, өкпенің қатерсіз түйіндері бар 292 пациенттен және I сатыдағы өкпе аденокарциномасы бар 229 пациенттен жиналды.695 субъектінің демографиялық сипаттамалары 1-қосымша кестеде көрсетілген.
1а суретінде көрсетілгендей, Сун Ят-сен университетінің онкологиялық орталығында 174 сау бақылау (HC), 170 қатерсіз түйіндер (BN) және 136 I сатыдағы өкпе аденокарциномасы (LA) үлгілерін қоса алғанда, барлығы 480 сарысу үлгілері жиналды.Ультра тиімді сұйық хроматография-жоғары ажыратымдылықтағы масс-спектрометрия (UPLC-HRMS) көмегімен мақсатсыз метаболомиялық профильге арналған ашу когорты.Қосымша 1-суретте көрсетілгендей, жіктеу моделін құру және дифференциалды жолды талдауды одан әрі зерттеу үшін LA және HC, LA және BN арасындағы дифференциалды метаболиттер анықталды.Сунь Ят-сен университетінің онкологиялық орталығы жинаған 104 үлгі және басқа екі аурухана жинаған 111 үлгі сәйкесінше ішкі және сыртқы валидациядан өтті.
Өте тиімді сұйық хроматография-жоғары ажыратымдылықтағы масс-спектрометрия (UPLC-HRMS) көмегімен жаһандық сарысу метаболомикасы талдауынан өткен ашылу когортындағы зерттеу популяциясы.b Зерттеу когортындағы 480 сарысу үлгілерінің жалпы метаболомасының ішінара ең кіші квадраттық дискриминант талдауы (PLS-DA), оның ішінде сау бақылаулар (HC, n = 174), қатерсіз түйіндер (BN, n = 170) және I сатыдағы өкпе аденокарциномасы (Лос-Анджелес, n = 136).+ESI, оң электроспрей иондау режимі, -ESI, теріс электроспрей иондау режимі.c–e Берілген екі топтағы (екі құйрықты Вилкоксон белгісі бар дәреже сынағы, жалған табу жылдамдығы түзетілген p мәні, FDR <0,05) молшылықтары айтарлықтай әртүрлі метаболиттер қызыл (қатпардың өзгеруі > 1,2) және көк (қатпардың өзгеруі < 0,83) түстермен көрсетілген. .) жанартау графигінде көрсетілген.f LA және BN арасындағы аннотацияланған метаболиттер санындағы елеулі айырмашылықтарды көрсететін иерархиялық кластерлік жылу картасы.Бастапқы деректер бастапқы деректер файлдары түрінде беріледі.
Табылған топтағы 174 HC, 170 BN және 136 LA жалпы сарысу метаболомы UPLC-HRMS талдауы арқылы талданды.Алдымен біз сапаны бақылау (QC) үлгілері ағымдағы зерттеу өнімділігінің тұрақтылығын растайтын, бақыланбайтын негізгі компоненттерді талдау (PCA) үлгісінің ортасында тығыз шоғырланатынын көрсетеміз (қосымша 2 сурет).
1 b суретіндегі ішінара ең кіші квадраттар-дискриминант талдауында (PLS-DA) көрсетілгендей, біз оң (+ESI) және теріс (−ESI) электроспрейді иондау режимдерінде LA және BN, LA және HC арасында айқын айырмашылықтар бар екенін анықтадық. .оқшауланған.Дегенмен, +ESI және -ESI жағдайында BN және HC арасында айтарлықтай айырмашылықтар табылмады.
Біз LA және HC арасындағы 382 дифференциалды ерекшелікті, LA және BN арасындағы 231 дифференциалды ерекшелікті және BN мен HC арасындағы 95 дифференциалды ерекшелікті таптық (Уилкоксон қолтаңбасы бойынша ранг сынағы, FDR <0,05 және көп өзгерістер >1,2 немесе <0,83) (сурет .1c-e) )..Мәліметтер базасына (mzCloud/HMDB/Chemspider кітапханасы) m/z мәні, сақтау уақыты және фрагментация массалық спектрін іздеу (мәлімет Әдістер бөлімінде сипатталған) 22 бойынша шыңдар қосымша аннотацияланды (Қосымша деректер 3).Соңында, LA-ға қарсы BN (1f-сурет және 2-кесте) және HC-ге қарсы LA (қосымша 3-сурет және 2-кесте) үшін сәйкесінше көптігі бойынша айтарлықтай айырмашылықтары бар 33 және 38 аннотацияланған метаболиттер анықталды.Керісінше, PLS-DA-дағы BN мен HC арасындағы сәйкестікке сәйкес, BN және HC-де (қосымша кесте 2) молшылықта айтарлықтай айырмашылықтары бар тек 3 метаболит анықталды.Бұл дифференциалды метаболиттер биохимиялық заттардың кең ауқымын қамтиды (қосымша 4-сурет).Біріктірілген бұл нәтижелер өкпенің қатерсіз түйіндерімен немесе сау субъектілермен салыстырғанда ерте сатыдағы өкпе обырының қатерлі трансформациясын көрсететін сарысу метаболомындағы елеулі өзгерістерді көрсетеді.Сонымен қатар, BN және HC қан сарысуындағы метаболомасының ұқсастығы өкпенің қатерсіз түйіндері сау адамдарда көптеген биологиялық сипаттамаларға ие болуы мүмкін екенін көрсетеді.Эпидермальды өсу факторы рецепторлары (EGFR) генінің мутациялары өкпенің аденокарциномасының 23 кіші типінде жиі кездесетінін ескере отырып, біз жүргізуші мутацияларының сарысу метаболомына әсерін анықтауға тырыстық.Содан кейін біз өкпе аденокарциномасы тобындағы EGFR мәртебесі бар 72 жағдайдың жалпы метаболомиялық профилін талдадық.Бір қызығы, біз PCA талдауында EGFR мутант пациенттері (n = 41) мен EGFR жабайы типті пациенттер (n = 31) арасындағы салыстырмалы профильдерді таптық (қосымша 5a сурет).Дегенмен, біз EGFR мутациясы бар емделушілерде жабайы типті EGFR бар емделушілермен салыстырғанда (t сынағы, p <0,05 және қатпарлы өзгеріс > 1,2 немесе <0,83) көптігі айтарлықтай өзгерген 7 метаболиттерді анықтадық (қосымша 5b сурет).Бұл метаболиттердің көпшілігі (7-ден 5-і) май қышқылдарының тотығу жолдарында маңызды рөл атқаратын ацилкарнитиндер болып табылады.
2 а-суретте көрсетілген жұмыс үрдісінде көрсетілгендей, түйіндерді жіктеу үшін биомаркерлер ең аз абсолютті жиырылу операторларын және LA (n = 136) және BN (n = 170) анықталған 33 дифференциалды метаболиттер негізінде таңдауды пайдалана отырып алынды.Айнымалылардың ең жақсы комбинациясы (LASSO) – екілік логистикалық регрессия моделі.Модельдің сенімділігін тексеру үшін он еселік кросс-валидация қолданылды.Айнымалыларды таңдау және параметрді реттеу λ24 параметрімен ықтималдықты барынша арттыру айыппұлымен реттеледі.Жаһандық метаболомика талдауы дискриминант моделінің жіктеу өнімділігін тексеру үшін ішкі валидация (n = 104) және сыртқы валидация (n = 111) топтарында тәуелсіз орындалды.Нәтижесінде, ашылу жиынындағы 27 метаболит ең үлкен орташа AUC мәні бар ең жақсы дискриминант үлгісі ретінде анықталды (2б-сурет), олардың ішінде 9-ында BN-мен салыстырғанда LA-да белсенділік жоғарылаған және 18-де белсенділік төмендеген (2c-сурет).
Он еселік кросс-валидация арқылы екілік логистикалық регрессия үлгісін пайдалана отырып, ашылу жиынындағы сарысу метаболиттерінің ең жақсы панелін таңдауды және ішкі және сыртқы валидация жиындарында болжамды өнімділікті бағалауды қоса, өкпе түйіндерінің жіктеуішін құруға арналған жұмыс процесі.b Метаболикалық биомаркерді таңдау үшін LASSO регрессия үлгісінің кросс-валидациялық статистикасы.Жоғарыда келтірілген сандар берілген λ кезінде таңдалған биомаркерлердің орташа санын білдіреді.Қызыл нүктелі сызық сәйкес ламбдадағы орташа AUC мәнін білдіреді.Сұр қате жолақтары ең төменгі және ең үлкен AUC мәндерін білдіреді.Нүктелі сызық таңдалған 27 биомаркері бар ең жақсы үлгіні көрсетеді.AUC, қабылдағыштың жұмыс сипаттамасы (ROC) қисығы астындағы аудан.c Табылған топтағы BN тобымен салыстырғанда LA тобындағы 27 таңдалған метаболиттің бүктелген өзгерістері.Қызыл баған – белсендіру.Көк баған - құлдырау.d–f Табылған, ішкі және сыртқы валидация жинақтарындағы 27 метаболит комбинациясына негізделген дискриминант үлгісінің қуатын көрсететін қабылдағыштың жұмыс сипаттамасы (ROC) қисықтары.Бастапқы деректер бастапқы деректер файлдары түрінде беріледі.
Осы 27 метаболиттің өлшенген регрессия коэффициенттері негізінде болжау үлгісі жасалды (қосымша 3 кесте).Осы 27 метаболитке негізделген ROC талдауы қисық астындағы аумақты (AUC) 0,933 мәнін берді, ашу тобының сезімталдығы 0,868 және ерекшелік 0,859 болды (2d-сурет).Сонымен қатар, LA және HC арасындағы 38 аннотацияланған дифференциалды метаболиттердің арасында 16 метаболиттің жиынтығы LA-ны HC-ден ажырату кезінде 0,801 сезімталдықпен және 0,856 ерекшелігімен 0,902 AUC мәніне қол жеткізді (қосымша 6a-c сурет).Сондай-ақ дифференциалды метаболиттер үшін әр түрлі қатпарлы өзгеру шектеріне негізделген AUC мәндері салыстырылды.Біз жіктеу моделінің LA және BN (HC) арасындағы айырмашылықты 1,2-ге қарсы 1,5 немесе 2,0-ге теңестіру кезінде ең жақсы орындағанын анықтадық (қосымша 7a, b сурет).27 метаболит тобына негізделген жіктеу моделі ішкі және сыртқы когорталарда әрі қарай расталды.AUC ішкі валидация үшін 0,915 (сезімталдық 0,867, ерекшелік 0,811) және сыртқы валидация үшін 0,945 (сезімталдық 0,810, ерекшелік 0,979) болды (2e, f-сурет).Зертхана аралық тиімділікті бағалау үшін сыртқы когортадан алынған 40 үлгі Әдістер бөлімінде сипатталғандай сыртқы зертханада талданды.Жіктеу дәлдігі 0,925 AUC мәніне жетті (қосымша 8-сурет).Өкпенің жалпақ жасушалы карциномасы (LUSC) өкпе аденокарциномасынан (LUAD) кейін шағын жасушалы емес өкпе обырының (NSCLC) екінші ең көп таралған қосалқы түрі болғандықтан, біз метаболикалық профильдердің расталған әлеуетті пайдалылығын да сынадық.BN және LUSC-тің 16 жағдайы.LUSC және BN арасындағы кемсітушіліктің AUC мәні 0,776 (қосымша 9-сурет) болды, бұл LUAD және BN арасындағы кемсітушілікпен салыстырғанда нашар қабілеттілікті көрсетеді.
Зерттеулер КТ кескіндеріндегі түйіндердің мөлшері қатерлі ісік ықтималдығымен оң корреляцияланғанын көрсетті және түйіндерді емдеудің негізгі детерминанты болып қала береді25,26,27.NELSON скринингтік зерттеуінің үлкен когорты деректерін талдау түйіндері <5 мм субъектілердегі қатерлі ісік қаупі тіпті түйіндері жоқ субъектілердегі 28-ге ұқсас екенін көрсетті.Сондықтан, тұрақты КТ мониторингін қажет ететін ең аз өлшем Британдық Торакальды қоғам (BTS) ұсынғандай 5 мм және Флейшнер қоғамы 29 ұсынғандай 6 мм.Дегенмен, өлшемі 6 мм-ден асатын және анық емес өкпе түйіндері (IPN) деп аталатын айқын қатерсіз белгілері жоқ түйіндер клиникалық тәжірибеде бағалау мен басқарудағы негізгі қиындық болып қала береді30,31.Әрі қарай біз ашу және ішкі валидация когорттарынан жинақталған үлгілерді пайдалана отырып, түйін өлшемі метаболомиялық қолтаңбаларға әсер етті ме, жоқ па тексердік.27 расталған биомаркерлерге назар аудара отырып, біз алдымен HC және BN суб-6 мм метаболомдарының PCA профильдерін салыстырдық.Біз HC және BN үшін деректер нүктелерінің көпшілігінің қабаттасатынын анықтадық, бұл сарысудағы метаболит деңгейлерінің екі топта да бірдей екенін көрсетті (3a-сурет).Әртүрлі өлшем диапазонындағы мүмкіндік карталары BN және LA-да сақталған (3b, c-сурет), ал 6-20 мм диапазонында қатерлі және қатерсіз түйіндер арасында бөліну байқалды (3d-сурет).Бұл когорта 6-дан 20 мм-ге дейінгі түйіндердің қатерлі ісігін болжау үшін AUC 0,927, спецификасы 0,868 және сезімталдығы 0,820 болды (сурет 3e, f).Біздің нәтижелеріміз классификатор түйін өлшеміне қарамастан ерте қатерлі трансформациядан туындаған метаболикалық өзгерістерді анықтай алатынын көрсетеді.
ad 27 метаболиттен тұратын метаболикалық классификатор негізінде көрсетілген топтар арасындағы PCA профильдерін салыстыру.CC және BN < 6 мм.b BN < 6 мм қарсы BN 6–20 мм.LA-да 6–20 мм, LA 20–30 мм.g BN 6–20 мм және LA 6–20 мм.GC, n = 174;BN < 6 мм, n = 153;BN 6–20 мм, n = 91;LA 6–20 мм, n = 89;LA 20–30 мм, n = 77. e Қабылдағыштың жұмыс сипаттамасы (ROC) 6–20 мм түйіндер үшін дискриминант үлгісінің өнімділігін көрсететін қисық.f Ықтималдық мәндері 6–20 мм өлшемді түйіндер үшін логистикалық регрессия моделі негізінде есептелді.Сұр нүктелі сызық оңтайлы кесу мәнін білдіреді (0,455).Жоғарыдағы сандар Лос-Анджелес үшін болжанған істердің пайызын білдіреді.Екі жақты студенттің t сынамасын пайдаланыңыз.PCA, негізгі құрамдас талдау.Қисық астындағы AUC ауданы.Бастапқы деректер бастапқы деректер файлдары түрінде беріледі.
Ұсынылған қатерлі ісіктерді болжау үлгісінің өнімділігін көрсету үшін өкпе түйіндерінің өлшемдері ұқсас (7-9 мм) төрт үлгі (44-61 жас) әрі қарай таңдалды (4а, б-сурет).Бастапқы скринингте 1-жағдайда кальцинациясы бар қатты түйін ретінде ұсынылды, бұл жақсылықпен байланысты, ал 2-жағдай айқын қатерсіз белгілері жоқ анықталмаған жартылай қатты түйін ретінде ұсынылды.Үш раундтағы кейінгі КТ бұл жағдайлардың 4 жыл ішінде тұрақты болғанын және сондықтан қатерсіз түйіндер деп саналғанын көрсетті (4а-сурет).Сериялық КТ-сканерлеуді клиникалық бағалаумен салыстырғанда, қазіргі жіктеуіш үлгісімен бір реттік қан сарысуындағы метаболит талдауы ықтималдық шектеулеріне негізделген осы қатерсіз түйіндерді тез және дұрыс анықтады (1-кесте).3-жағдайдағы 4б-суретте плевраның тартылу белгілері бар түйін көрсетілген, ол көбінесе қатерлі ісікпен байланысты32.4-жағдай анық емес жартылай қатты түйін ретінде ұсынылды, себебі қатер дәлелі жоқ.Барлық осы жағдайлар классификатор моделіне сәйкес қатерлі деп болжанған (1-кесте).Өкпенің аденокарциномасын бағалау өкпе резекциясынан кейінгі гистологиялық зерттеу арқылы көрсетілді (4б-сурет).Сыртқы валидация жинағы үшін метаболикалық жіктеуіш 6 мм-ден асатын анықталмаған өкпе түйіндерінің екі жағдайын дәл болжады (қосымша 10 сурет).
Екі жағдайдағы қатерсіз түйіндердің өкпенің осьтік терезесінің КТ суреті.1-жағдайда, 4 жылдан кейін КТ оң жақ төменгі бөлігінде кальцификациямен 7 мм өлшемді тұрақты тұтас түйінді көрсетті.2-жағдайда 5 жылдан кейін КТ оң жақ жоғарғы бөлігінде диаметрі 7 мм тұрақты, жартылай тұтас түйін анықталды.b Өкпенің осьтік терезе КТ суреттері және өкпе резекциясына дейінгі I сатыдағы аденокарциноманың екі жағдайының сәйкес патологиялық зерттеулері.3-жағдайда оң жақ жоғарғы бөлігінде диаметрі 8 мм, плевра тартылуы бар түйін анықталды.4-жағдайда сол жақ жоғарғы бөлігінде 9 мм өлшемді жартылай тұтас шыны тәрізді түйін анықталды.Өкпе аденокарциномасының ацинарлық өсу үлгісін көрсететін резекцияланған өкпе тінінің гематоксилин және эозин (H&E) бояуы (шкала жолағы = 50 мкм).Көрсеткілер КТ кескіндерінде анықталған түйіндерді көрсетеді.H&E суреттері патолог зерттеген бірнеше (>3) микроскопиялық өрістердің репрезентативті кескіндері болып табылады.
Бірге алғанда, біздің нәтижелеріміз КТ скринингін бағалау кезінде қиындықтар тудыруы мүмкін өкпе түйіндерінің дифференциалды диагностикасындағы сарысу метаболиті биомаркерлерінің әлеуетті мәнін көрсетеді.
Валидталған дифференциалды метаболит панеліне сүйене отырып, біз негізгі метаболикалық өзгерістердің биологиялық корреляциясын анықтауға тырыстық.MetaboAnalyst арқылы KEGG жолын байыту талдауы екі берілген топ арасындағы 6 жалпы айтарлықтай өзгертілген жолдарды анықтады (LA қарсы HC және LA қарсы BN, түзетілген p ≤ 0,001, әсер > 0,01).Бұл өзгерістер пируват алмасуының, триптофан алмасуының, ниацин мен никотинамид алмасуының, гликолиздің, TCA циклінің және пурин алмасуының бұзылуымен сипатталды (5а-сурет).Содан кейін абсолютті сандық бағалауды қолдана отырып, негізгі өзгерістерді тексеру үшін мақсатты метаболомиканы орындадық.Түпнұсқалық метаболит стандарттарын пайдалана отырып, үштік төрт полюсті масс-спектрометрия (QQQ) арқылы жалпы өзгертілген жолдардағы жалпы метаболиттерді анықтау.Метаболомиканы зерттеудің мақсатты үлгісінің демографиялық сипаттамалары қосымша 4-кестеге енгізілген. Біздің жаһандық метаболомика нәтижелеріне сәйкес, сандық талдау гипоксантин мен ксантин, пируват және лактаттың BN және HC-мен салыстырғанда LA-да жоғарылағанын растады (5b, c-сурет, c, p <0,05).Дегенмен, BN және HC арасында бұл метаболиттерде айтарлықтай айырмашылықтар табылған жоқ.
BN және HC топтарымен салыстырғанда LA тобындағы айтарлықтай әртүрлі метаболиттердің KEGG жолын байыту талдауы.Екі құйрықты Globaltest қолданылды және p мәндері Холм-Бонферрони әдісімен түзетілді (реттелген p ≤ 0,001 және әсер мөлшері > 0,01).b–d LC-MS/MS арқылы анықталған HC, BN және LA сарысуындағы гипоксантин, ксантин, лактат, пируват және триптофан деңгейлерін көрсететін скрипка сызбалары (әр топқа n = 70).Ақ және қара нүктелі сызықтар сәйкесінше медиана мен квартильді көрсетеді.e LUAD-TCGA деректер жинағындағы қалыпты өкпе тінімен (n = 59) салыстырғанда өкпе аденокарциномасындағы (n = 513) SLC7A5 және QPRT нормаланған Log2TPM (миллиондағы транскрипт) mRNA экспрессиясын көрсететін скрипка сызбасы.Ақ жолақ квартильаралық диапазонды, ортадағы көлденең қара сызық медиананы, ал қораптан шығатын тік қара сызық 95% сенімділік аралығын (CI) білдіреді.f TCGA деректер жинағындағы өкпе аденокарциномасындағы (n = 513) және қалыпты өкпе тініндегі (n = 59) SLC7A5 және GAPDH экспрессиясының Пирсон корреляция графигі.Сұр аймақ 95% CI құрайды.r, Пирсон корреляция коэффициенті.g LC-MS/MS арқылы анықталған спецификалық емес shRNA бақылауымен (NC) және shSLC7A5 (Sh1, Sh2) арқылы трансфекцияланған A549 жасушаларындағы қалыпты жасушалық триптофан деңгейлері.Әр топтағы бес биологиялық тәуелсіз үлгінің статистикалық талдауы ұсынылған.h A549 ұяшықтарындағы (NC) және SLC7A5 нокдаундағы A549 жасушаларындағы (Sh1, Sh2) NADt (жалпы NAD, соның ішінде NAD+ және NADH) жасушалық деңгейлері.Әр топтағы үш биологиялық тәуелсіз үлгінің статистикалық талдауы ұсынылған.i A549 жасушаларының SLC7A5 құлауына дейінгі және одан кейінгі гликолитикалық белсенділігі жасушадан тыс қышқылдану жылдамдығымен (ECAR) өлшенді (n = әр топқа 4 биологиялық тәуелсіз үлгі).2-DG,2-дезокси-D-глюкоза.Екі құйрықты студенттің t сынағы (b–h) қолданылды.(g–i) қателік жолақтары орташа ± SD мәнін білдіреді, әрбір эксперимент үш рет тәуелсіз орындалды және нәтижелер ұқсас болды.Бастапқы деректер бастапқы деректер файлдары түрінде беріледі.
LA тобындағы өзгертілген триптофан метаболизмінің елеулі әсерін ескере отырып, біз QQQ көмегімен HC, BN және LA топтарындағы сарысу триптофан деңгейін де бағаладық.Біз қан сарысуындағы триптофанның HC немесе BN (p <0,001, 5d сурет) салыстырғанда LA-да азайғанын анықтадық, бұл айналымдағы триптофан деңгейі өкпе обыры бар науқастарда бақылау тобындағы дені сау адамдармен салыстырғанда төмен екендігі туралы алдыңғы мәліметтерге сәйкес келеді33,34 ,35.PET/CT tracer 11C-метил-L-триптофан қолданылған басқа зерттеу өкпенің қатерлі ісігі тінінде триптофан сигналын сақтау уақыты қатерсіз зақымданулармен немесе қалыпты тіндермен салыстырғанда айтарлықтай жоғарылағанын көрсетті36.Біз LA сарысуындағы триптофанның төмендеуі өкпенің қатерлі ісігі жасушаларының белсенді триптофанды қабылдауын көрсетуі мүмкін деп болжаймыз.
Сондай-ақ, триптофан катаболизмінің кинуренин жолының соңғы өнімі NAD+37,38 екені белгілі, ол гликолизде глицеральдегид-3-фосфаттың 1,3-бисфосфоглицератпен реакциясы үшін маңызды субстрат болып табылады39.Алдыңғы зерттеулер иммундық реттеудегі триптофан катаболизмінің рөліне назар аударғанымен, біз осы зерттеуде байқалған триптофанның реттелуінің бұзылуы мен гликолитикалық жолдар арасындағы өзара әрекетті түсіндіруге тырыстық.Ерітіндіні тасымалдаушы отбасы 7 мүше 5 (SLC7A5) триптофан тасымалдаушы екені белгілі43,44,45.Хинолин қышқылының фосфорибозилтрансферазасы (QPRT) - хинолин қышқылын NAMN46 түрлендіретін кинуренин жолының төменгі жағында орналасқан фермент.LUAD TCGA деректер жинағын тексеру SLC7A5 және QPRT екеуі де қалыпты тінмен салыстырғанда ісік тінінде айтарлықтай жоғары реттелетінін көрсетті (5e-сурет).Бұл өсу I және II кезеңдерінде, сондай-ақ өкпе аденокарциномасының III және IV кезеңдерінде байқалды (қосымша 11 сурет), бұл ісік пайда болуымен байланысты триптофан метаболизмінің ерте бұзылуларын көрсетеді.
Сонымен қатар, LUAD-TCGA деректер жинағы онкологиялық науқас үлгілеріндегі SLC7A5 және GAPDH mRNA экспрессиясы арасындағы оң корреляцияны көрсетті (r = 0,45, p = 1,55E-26, 5f сурет).Керісінше, қалыпты өкпе тінінде мұндай гендік белгілер арасында маңызды корреляция табылған жоқ (r = 0,25, p = 0,06, 5f сурет).A549 жасушаларында SLC7A5 (қосымша 12-сурет) жойылуы жасушалық триптофан мен NAD(H) деңгейлерін айтарлықтай төмендетті (5g,h-сурет), нәтижесінде жасушадан тыс қышқылдану жылдамдығы (ECAR) арқылы өлшенген гликолитикалық белсенділік әлсіреген (1-сурет).5i).Осылайша, сарысудағы метаболикалық өзгерістерге және in vitro анықтауға сүйене отырып, біз триптофан метаболизмі кинуренин жолы арқылы NAD+ тудыруы мүмкін және өкпе ісігіндегі гликолизді ынталандыруда маңызды рөл атқара алады деп болжаймыз.
Зерттеулер көрсеткендей, LDCT арқылы анықталған анықталмаған өкпе түйіндерінің үлкен саны қатерлі ісіктің жалған-оң диагнозына байланысты PET-CT, өкпе биопсиясы және шамадан тыс емдеу сияқты қосымша сынақтар қажеттілігіне әкелуі мүмкін.31 6-суретте көрсетілгендей, біздің зерттеуіміз тәуекелді стратификациялауды және КТ арқылы анықталған өкпе түйіндерін кейіннен басқаруды жақсартатын ықтимал диагностикалық мәні бар сарысу метаболиттерінің панелін анықтады.
Өкпе түйіндері қатерсіз немесе қатерлі себептерді көрсететін бейнелеу ерекшеліктері бар төмен дозалы компьютерлік томография (LDCT) көмегімен бағаланады.Түйіндердің белгісіз нәтижесі жиі бақылауға, қажетсіз араласуға және шамадан тыс емдеуге әкелуі мүмкін.Диагностикалық мәні бар қан сарысуындағы метаболикалық жіктеуіштерді қосу тәуекелді бағалауды және өкпе түйіндерін кейіннен басқаруды жақсартуы мүмкін.ПЭТ позитронды эмиссиялық томография.
АҚШ-тың NLST зерттеуі мен еуропалық NELSON зерттеуінің деректері төмен дозалы компьютерлік томография (LDCT) көмегімен жоғары тәуекел тобына скрининг жүргізу өкпенің қатерлі ісігінен өлім-жітімді азайтуы мүмкін екенін көрсетеді1,3.Дегенмен, LDCT арқылы анықталған кездейсоқ өкпе түйіндерінің үлкен санын тәуекелді бағалау және кейінгі клиникалық басқару ең қиын болып қала береді.Негізгі мақсат - сенімді биомаркерлерді қосу арқылы қолданыстағы LDCT негізіндегі хаттамалардың дұрыс жіктелуін оңтайландыру.
Қанның метаболиттері сияқты кейбір молекулалық биомаркерлер өкпенің қатерлі ісігін сау бақылаулармен салыстыру арқылы анықталды15,17.Ағымдағы зерттеуде біз LDCT кездейсоқ анықталған қатерсіз және қатерлі өкпе түйіндерін ажырату үшін сарысу метаболомикасы талдауын қолдануға назар аудардық.Біз UPLC-HRMS талдауын қолдана отырып, сау бақылаудың (HC), жақсы өкпе түйіндерінің (BN) және I сатыдағы өкпе аденокарциномасының (LA) үлгілерінің жаһандық сарысу метаболомын салыстырдық.Біз HC және BN ұқсас метаболикалық профильдерге ие екенін анықтадық, ал LA HC және BN салыстырғанда айтарлықтай өзгерістерді көрсетті.Біз LA-ны HC және BN-ден ажырататын сарысу метаболиттерінің екі жиынтығын анықтадық.
Ағымдағы LDCT негізіндегі қатерсіз және қатерлі түйіндерді сәйкестендіру схемасы негізінен түйіндердің көлеміне, тығыздығына, морфологиясына және уақыт бойынша өсу жылдамдығына негізделген30.Алдыңғы зерттеулер түйіндердің мөлшері өкпенің қатерлі ісігінің ықтималдығымен тығыз байланысты екенін көрсетті.Тіптен қауіптілігі жоғары емделушілерде <6 мм түйіндерде қатерлі ісік қаупі <1% құрайды.6-дан 20 мм-ге дейінгі түйіндер үшін қатерлі ісік қаупі 8%-дан 64%-ға дейін ауытқиды30.Сондықтан, Fleischner Society КТ жоспарлы бақылау үшін 6 мм кесу диаметрін ұсынады.29 Дегенмен, 6 мм-ден асатын анықталмаған өкпе түйіндерінің (IPN) тәуекелін бағалау және басқару тиісті түрде орындалмаған 31 .Туа біткен жүрек ақауын ағымдағы басқару әдетте КТ мониторингімен мұқият күтуге негізделген.
Валидталған метаболома негізінде біз бірінші рет сау адамдар мен <6 мм қатерсіз түйіндер арасындағы метаболомиялық белгілердің қабаттасуын көрсеттік.Биологиялық ұқсастық CT <6 мм түйіндер үшін қатерлі ісік қаупі түйіндері жоқ субъектілердегі сияқты төмен екендігі туралы бұрынғы КТ нәтижелеріне сәйкес келеді.30 Біздің нәтижелеріміз де <6 мм және ≥6 мм қатерсіз түйіндердің жоғары екенін көрсетеді. метаболомиялық профильдердегі ұқсастық, қатерсіз этиологияның функционалдық анықтамасы түйін өлшеміне қарамастан сәйкес келетінін көрсетеді.Осылайша, қазіргі заманғы диагностикалық сарысу метаболитінің панельдері КТ-да түйіндер бастапқыда анықталған кезде бір талдауды жоққа шығаратын сынақ ретінде қамтамасыз ете алады және сериялық бақылауды ықтимал азайтуы мүмкін.Сонымен қатар, метаболикалық биомаркерлердің сол панелі өлшемі ≥6 мм қатерлі түйіндерді қатерсіз түйіндерден ажыратты және КТ кескіндерінде ұқсас өлшемдегі IPN және анық емес морфологиялық белгілер үшін дәл болжамды қамтамасыз етті.Бұл сарысудағы метаболизм классификаторы AUC 0,927 болатын ≥6 мм түйіндердің қатерлі ісігін болжауда жақсы нәтиже көрсетті.Біріктірілген нәтижелер қан сарысуындағы бірегей метаболикалық белгілер ісік тудырған метаболикалық өзгерістерді ерекше көрсете алатынын және түйін өлшеміне тәуелсіз тәуекелді болжаушылар ретінде әлеуетті мәнге ие екенін көрсетеді.
Атап айтқанда, өкпе аденокарциномасы (LUAD) және скамозды жасушалық карцинома (LUSC) өкпенің ұсақ жасушалы емес қатерлі ісігінің (NSCLC) негізгі түрлері болып табылады.LUSC темекі тұтынумен тығыз байланысты47 және LUAD КТ скринингінде анықталған кездейсоқ өкпе түйіндерінің ең көп тараған гистологиясы екенін ескере отырып48, біздің классификатор үлгісі I сатыдағы аденокарцинома үлгілері үшін арнайы жасалған.Ванг және оның әріптестері сонымен қатар LUAD-ға назар аударды және ерте сатыдағы өкпе обырын сау адамдардан ажырату үшін липидомиканы пайдалана отырып, тоғыз липидті белгілерді анықтады17.Біз ағымдағы жіктеуіш үлгісін I сатыдағы LUSC және 74 қатерсіз түйіндердің 16 жағдайында сынадық және LUAD және LUSC-тің өздерінің метаболомиялық қолтаңбалары болуы мүмкін екенін болжайтын LUSC болжау дәлдігінің төмендігін (AUC 0,776) байқадық.Шынында да, LUAD және LUSC этиологиясы, биологиялық шығу тегі және генетикалық аберрациялары бойынша ерекшеленеді49.Сондықтан скринингтік бағдарламаларда өкпе обырын популяциялық анықтауға арналған оқыту үлгілеріне гистологияның басқа түрлерін қосу керек.
Мұнда біз сау бақылаулар мен қатерсіз түйіндермен салыстырғанда өкпе аденокарциномасындағы ең жиі өзгеретін алты жолды анықтадық.Ксантин мен гипоксантин пуриндік метаболизм жолының жалпы метаболиттері болып табылады.Біздің нәтижелерімізге сәйкес, пурин метаболизмімен байланысты аралық өнімдер өкпе аденокарциномасы бар пациенттердің қан сарысуында немесе тіндерінде дені сау бақылаулармен немесе преинвазивті кезеңдегі пациенттермен салыстырғанда айтарлықтай жоғарылады15,50.Қан сарысуындағы ксантин мен гипоксантин деңгейлерінің жоғарылауы рак клеткаларының тез көбеюіне қажетті анаболизмді көрсетуі мүмкін.Глюкоза метаболизмінің бұзылуы қатерлі ісік метаболизмінің белгілі белгісі болып табылады51.Мұнда біз HC және BN тобымен салыстырғанда LA тобында пируват пен лактаттың айтарлықтай жоғарылауын байқадық, бұл ұсақ жасушалы емес өкпенің қатерлі ісігі (NSCLC) пациенттерінің қан сарысуындағы метаболома профиліндегі гликолитикалық жолдың ауытқулары туралы алдыңғы есептерге сәйкес келеді және сау бақылаулар.нәтижелер сәйкес келеді52,53.
Маңыздысы, біз өкпе аденокарциномасының сарысуындағы пируват пен триптофан метаболизмі арасындағы кері корреляцияны байқадық.Қан сарысуындағы триптофан деңгейі HC немесе BN тобымен салыстырғанда LA тобында төмендеді.Бір қызығы, болашақ когортты пайдаланатын алдыңғы ауқымды зерттеу айналымдағы триптофанның төмен деңгейі өкпенің қатерлі ісігінің 54 қаупінің жоғарылауымен байланысты екенін анықтады.Триптофан - біз толығымен тамақтан алатын маңызды амин қышқылы.Өкпенің аденокарциномасында қан сарысуындағы триптофанның азаюы осы метаболиттің тез таусылуын көрсетуі мүмкін деген қорытындыға келдік.Кинуренин жолы арқылы триптофан катаболизмінің соңғы өнімі де жаңа NAD+ синтезінің көзі болып табылатыны белгілі.NAD+ негізінен құтқару жолы арқылы өндірілетіндіктен, денсаулық пен аурудағы триптофан метаболизміндегі NAD+ маңыздылығын анықтау қажет46.TCGA дерекқорын талдауымыз триптофан тасымалдаушысының еріген затты тасымалдаушы 7A5 (SLC7A5) экспрессиясы қалыпты бақылаулармен салыстырғанда өкпе аденокарциномасында айтарлықтай жоғарылағанын және GAPDH гликолитикалық ферментінің экспрессиясымен оң корреляцияланғанын көрсетті.Алдыңғы зерттеулер негізінен ісікке қарсы иммундық жауапты басудағы триптофан катаболизмінің рөліне назар аударды40,41,42.Мұнда біз өкпенің қатерлі ісігі жасушаларында SLC7A5 тітіркену арқылы триптофанның жұтылуының тежелуі жасушалық NAD деңгейлерінің кейіннен төмендеуіне және гликолитикалық белсенділіктің бір мезгілде әлсіреуіне әкелетінін көрсетеміз.Қорытындылай келе, біздің зерттеуіміз өкпе аденокарциномасының қатерлі трансформациясымен байланысты сарысу метаболизміндегі өзгерістердің биологиялық негізін береді.
EGFR мутациялары NSCLC бар науқастарда ең көп таралған драйвер мутациялары болып табылады.Біздің зерттеуімізде EGFR мутациясы бар емделушілерде (n = 41) жабайы типті EGFR (n = 31) бар емделушілерге ұқсас жалпы метаболомиялық профильдер бар екенін анықтадық, дегенмен ацилкарнитинді емделушілердегі кейбір EGFR мутантты емделушілердің сарысу деңгейінің төмендегенін анықтадық.Ацилкарнитиндердің белгіленген қызметі ацил топтарын цитоплазмадан митохондриялық матрицаға тасымалдау болып табылады, бұл энергияны өндіру үшін май қышқылдарының тотығуына әкеледі 55 .Біздің қорытындыларымызға сәйкес, жақында жүргізілген зерттеу 102 өкпе аденокарциномасы тінінің үлгілерінің жаһандық метаболомын талдау арқылы EGFR мутанты мен EGFR жабайы типті ісіктері арасындағы ұқсас метаболом профильдерін де анықтады50.Бір қызығы, ацилкарнитиннің мазмұны EGFR мутант тобында да табылды.Сондықтан, ацилкарнитин деңгейіндегі өзгерістер EGFR-индукцияланған метаболикалық өзгерістерді көрсете ме, жоқ па, оның негізгі молекулалық жолдары әрі қарай зерттеуге лайық болуы мүмкін.
Қорытындылай келе, біздің зерттеуіміз өкпе түйіндерінің дифференциалды диагностикасы үшін қан сарысуындағы метаболикалық классификаторды белгілейді және КТ скринингі негізінде тәуекелді бағалауды оңтайландыратын және клиникалық басқаруды жеңілдететін жұмыс процесін ұсынады.
Бұл зерттеуді Сунь Ятсен университетінің онкологиялық ауруханасының Этика комитеті, Сунь Ятсен университетінің бірінші еншілес ауруханасы және Чжэнчжоу университетінің онкологиялық ауруханасының этика комитеті мақұлдады.Ашу және ішкі валидация топтарында сау адамдардан 174 қан сарысуы және қатерсіз түйіндерден 244 сарысулар Сун Ятсен университетінің қатерлі ісік орталығында жыл сайынғы медициналық тексеруден өтетін адамдардан және 166 қатерсіз түйіндерден жиналды.сарысу.I кезеңдегі өкпе аденокарциномалары Сунь Ятсен университетінің онкологиялық орталығынан жиналды.Сыртқы валидация когортында қатерсіз түйіндердің 48 жағдайы, Сунь Ятсен университетінің бірінші филиалындағы ауруханасынан I сатыдағы өкпе аденокарциномасының 39 жағдайы және Чжэнчжоу онкологиялық ауруханасынан I сатыдағы өкпе аденокарциномасының 24 жағдайы болды.Сунь Ятсен университетінің онкологиялық орталығы сонымен қатар белгіленген метаболикалық классификатордың диагностикалық қабілетін тексеру үшін I сатыдағы жалпақ жасушалы өкпе обырының 16 жағдайын жинады (науқас сипаттамалары қосымша 5 кестеде көрсетілген).Ашу когорты мен ішкі валидация когортынан үлгілер 2018 жылдың қаңтары мен 2020 жылдың мамыры аралығында жиналды. Сыртқы валидация когорты үшін үлгілер 2021 жылдың тамызы мен 2022 жылдың қазаны аралығында жиналды. Гендерлік ауытқуларды азайту үшін әрқайсысына ерлер мен әйелдердің шамамен бірдей саны тағайындалды. когорта.Ашу тобы және ішкі шолу тобы.Қатысушының жынысы өзін-өзі есеп беру негізінде анықталды.Барлық қатысушылардан ақпараттандырылған келісім алынды және өтемақы төленбейді.Қатерсіз түйіндері бар субъектілер операцияға дейін жиналған және гистопатологиямен диагноз қойылған сыртқы валидация үлгісінен 1 жағдайды қоспағанда, талдау кезінде 2-5 жас аралығындағы тұрақты КТ көрсеткіштері бар адамдар болды.Созылмалы бронхиттен басқа.Өкпе аденокарциномасының жағдайлары өкпе резекциясына дейін жиналып, патологиялық диагнозбен расталды.Аш қарынға қан сынамалары ешқандай антикоагулянттарсыз сарысуды бөлетін түтіктерде жиналды.Қан үлгілері бөлме температурасында 1 сағат ұйыған, содан кейін сарысу үстіңгі затын жинау үшін 4°C температурада 10 минут бойы 2851 × г центрифугаланған.Сарысудың аликвоты метаболит экстракциясына дейін -80°C температурада мұздатылған.Сун Ятсен университетінің онкологиялық орталығының қатерлі ісіктің алдын алу және медициналық сараптама бөлімі 40 пен 55 жас аралығындағы ерлер мен әйелдердің тең санын қоса алғанда, 100 сау донордан сарысу пулын жинады.Әрбір донор үлгісінің тең көлемдері араластырылды, алынған пул алквоталанып, -80°C температурада сақталады.Сарысу қоспасы сапаны бақылау және деректерді стандарттау үшін анықтамалық материал ретінде пайдаланылды.
Анықтамалық сарысу және сынақ үлгілері ерітілді және метаболиттер аралас экстракция әдісін (MTBE/метанол/су) 56 пайдаланып экстракцияланды.Қысқаша айтқанда, 50 мкл сарысу 225 мкл мұздай метанолмен және 750 мкл мұздай метил терт-бутил эфирімен (МТBE) араластырылды.Қоспаны араластырыңыз және мұзда 1 сағат бойы инкубациялаңыз.Содан кейін үлгілер араласып, ішкі стандарттары бар (13С-лактат, 13С3-пируват, 13С-метионин және 13С6-изолейцин, Кембридж изотоптары зертханаларынан сатып алынған) 188 мкл MS сортты сумен араластырылды.Содан кейін қоспаны 4 °C температурада 10 минут бойы 15000 × г центрифугалады, ал төменгі фаза оң және теріс режимдерде LC-MS талдауы үшін екі түтікке (әрқайсысы 125 мкл) ауыстырылды.Соңында үлгі жоғары жылдамдықтағы вакуумдық концентраторда кепкенге дейін буландырылды.
Кептірілген метаболиттер 120 мкл 80% ацетонитрилде қалпына келтірілді, 5 минут бойы құйынды және 4 ° C температурада 10 минут бойы 15 000 × г центрифугалады.Супернатанттар метаболомиканы зерттеу үшін микро кірістірулері бар сары шыны флакондарға ауыстырылды.Өте тиімді сұйық хроматография-жоғары ажыратымдылықтағы масс-спектрометрия (UPLC-HRMS) платформасында мақсатсыз метаболомика талдауы.Метаболиттер Dionex Ultimate 3000 UPLC жүйесі және ACQUITY BEH амид колонкасы (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters) арқылы бөлінді.Оң иондық режимде жылжымалы фазалар 95% (A) және 50% ацетонитрил (В) болды, олардың әрқайсысында 10 ммоль/л аммоний ацетаты және 0,1% құмырсқа қышқылы бар.Теріс режимде жылжымалы A және B фазаларында сәйкесінше 95% және 50% ацетонитрил болды, екі фазада 10 ммоль/л аммоний ацетаты бар, pH = 9. Градиент бағдарламасы келесідей болды: 0–0,5 мин, 2% B;0,5–12 мин, 2–50% B;12–14 мин, 50–98% B;14–16 мин, 98% B;16–16.1.мин, 98 –2% B;16,1–20 мин, 2% B. Баған 40°C температурада, ал үлгі 10°C автоүлгілеуіште ұсталды.Ағын жылдамдығы 0,3 мл/мин, инъекция көлемі 3 мкл.Электр спрей ионизациясы (ESI) көзі бар Q-Exactive Orbitrap масс-спектрометрі (Thermo Fisher Scientific) деректердің үлкен көлемін жинау үшін толық сканерлеу режимінде және ddMS2 бақылау режимімен біріктірілді.MS параметрлері келесідей орнатылды: бүріккіш кернеу +3,8 кВ/- 3,2 кВ, капиллярлық температура 320°C, қорғаныс газы 40 арб, қосалқы газ 10 арб, зонд қыздырғышының температурасы 350°C, сканерлеу диапазоны 70–1050 м/сағ, рұқсат.70 000. Деректер Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) көмегімен алынды.
Деректер сапасын бағалау үшін жинақталған сапаны бақылау (QC) үлгілері әрбір үлгіден үстіңгі заттың 10 мкл аликвотын алу арқылы жасалды.UPLC-MS жүйесінің тұрақтылығын бағалау үшін аналитикалық тізбектің басында алты сапаны бақылау үлгісінің инъекциясы талданды.Содан кейін сапаны бақылау үлгілері кезеңді түрде партияға енгізіледі.Осы зерттеудегі сарысу үлгілерінің барлық 11 партиясы LC-MS арқылы талданды.100 сау донордан алынған сарысу бассейні қоспасының аликвоталары экстракция процесін бақылау және партиядан партияға әсер етуді реттеу үшін сәйкес партиялардағы анықтамалық материал ретінде пайдаланылды.Сун Ятсен университетінің Метаболомика орталығында ашу когорты, ішкі валидация когорты және сыртқы валидация когортасының мақсатсыз метаболомика талдауы жасалды.Гуандун университетінің технологиялық талдау және сынау орталығының сыртқы зертханасы да классификатор үлгісінің өнімділігін тексеру үшін сыртқы когортадан алынған 40 үлгіні талдады.
Экстракциядан және қалпына келтіруден кейін қан сарысуындағы метаболиттердің абсолютті сандық көрсеткіштері ультра жоғары өнімді сұйық хроматография-тандем масс-спектрометриясының (Agilent 6495 үштік төртполюсті) электроспрей ионизациясының (ESI) көзі көп реакцияларды бақылау (MRM) режимінде өлшенді.Метаболиттерді бөлу үшін ACQUITY BEH амид колонкасы (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters) пайдаланылды.Жылжымалы фаза 10 ммоль/л аммоний ацетаты және 0,1% аммиак ерітіндісі бар 90% (A) және 5% ацетонитрилден (В) тұрды.Градиент бағдарламасы келесідей болды: 0–1,5 мин, 0% B;1,5–6,5 мин, 0–15% B;6,5–8 мин, 15% B;8–8,5 мин, 15%–0% B;8,5–11,5 мин, 0%В.Колонна 40 °C температурада және сынама 10 °C автосынамалауышта ұсталды.Ағын жылдамдығы 0,3 мл/мин және инъекция көлемі 1 мкл болды.MS параметрлері келесідей орнатылды: капиллярлық кернеу ±3,5 кВ, небулайзер қысымы 35 psi, қабықтағы газ шығыны 12 л/мин, қабық газының температурасы 350°C, кептіру газының температурасы 250°C, кептіру газының шығыны 14 л/мин.Триптофан, пируват, лактат, гипоксантин және ксантиннің MRM конверсиялары 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 және 151,0–107 болды.тиісінше 9.Деректер Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) көмегімен жиналды.Сарысу үлгілері үшін триптофан, пируват, лактат, гипоксантин және ксантин стандартты қоспа ерітінділерінің калибрлеу қисық сызығының көмегімен сандық түрде анықталды.Жасуша үлгілері үшін триптофан мазмұны ішкі стандартқа және жасуша ақуызының массасына қалыпқа келтірілді.
Ең жоғары экстракция (м/з және ұстау уақыты (RT)) Compound Discovery 3.1 және TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) көмегімен орындалды.Топтамалар арасындағы әлеуетті айырмашылықтарды жою үшін салыстырмалы молшылықты алу үшін сынақ үлгісінің әрбір сипаттамалық шыңы сол партиядан алынған эталондық материалдың сипаттамалық шыңына бөлінді.Стандарттауға дейінгі және одан кейінгі ішкі стандарттардың салыстырмалы стандартты ауытқулары Қосымша 6-кестеде көрсетілген. Екі топ арасындағы айырмашылықтар жалған табу жылдамдығымен (FDR<0,05, Вилкоксон таңбалы дәреже сынағы) және қатпарлардың өзгеруімен (>1,2 немесе <0,83) сипатталды.Алынған мүмкіндіктердің өңделмеген MS деректері және анықтамалық сарысумен түзетілген MS деректері тиісінше 1-қосымша және 2-қосымша деректерде көрсетілген.Пик аннотация идентификацияның төрт анықталған деңгейі негізінде орындалды, оның ішінде анықталған метаболиттер, болжамды аннотацияланған қосылыстар, болжамды сипатталған қосылыс сыныптары және белгісіз қосылыстар 22 .Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) дерекқорын іздеу негізінде расталған стандарттарға сәйкес келетін MS/MS немесе mzCloud (балл > 85) немесе Chemspider ішіндегі дәл сәйкестік аннотациялары бар биологиялық қосылыстар дифференциалды метаболома арасындағы аралық өнім ретінде ақырында таңдалды.Әрбір мүмкіндік үшін ең жоғары аннотациялар Қосымша деректер 3-ке енгізілген. MetaboAlyst 5.0 қосындысы нормаланған метаболит көптігін бір айнымалы талдау үшін пайдаланылды.MetaboAlyst 5.0 сонымен қатар айтарлықтай әртүрлі метаболиттер негізінде KEGG жолын байыту талдауын бағалады.Негізгі құрамдас талдау (PCA) және ішінара ең кіші квадраттарды дискриминанттық талдау (PLS-DA) стек қалыпқа келтіру және автомасштабтау арқылы ropls бағдарламалық пакетін (v.1.26.4) пайдаланып талданды.Түйіндердің қатерлі ісігін болжауға арналған оңтайлы метаболит биомаркерінің моделі ең аз абсолютті жиырылу және таңдау операторы (LASSO, R пакеті v.4.1-3) бар екілік логистикалық регрессия арқылы жасалды.Анықтау және валидация жинақтарындағы дискриминант үлгісінің өнімділігі pROC пакетіне (v.1.18.0.) сәйкес ROC талдауына негізделген AUC бағалауымен сипатталды.Оңтайлы ықтималдық шегі модельдің максималды Юден индексі негізінде алынды (сезімталдық + ерекшелік – 1).Мәндері шекті мәннен аз немесе жоғары үлгілер сәйкесінше қатерсіз түйіндер және өкпе аденокарциномасы ретінде болжанады.
A549 жасушалары (#CCL-185, American Type Culture Collection) құрамында 10% FBS бар F-12K ортасында өсірілді.SLC7A5 бағытталған қысқа шаш қыстырғыш РНҚ (shRNA) тізбегі және мақсатсыз басқару (NC) pLKO.1-puro лентивирустық векторына енгізілді.shSLC7A5 антисенс тізбегі келесідей: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).SLC7A5 (№5347) және тубулинге (№2148) антиденелер Cell Signaling Technology компаниясынан сатып алынды.SLC7A5 және тубулинге антиденелер Western blot талдауы үшін 1:1000 сұйылтуда қолданылды.
Seahorse XF гликолитикалық стресс сынағы жасушадан тыс қышқылдану (ECAR) деңгейін өлшейді.Талдауда глюкоза, олигомицин A және 2-DG ECAR өлшенген жасушалық гликолитикалық қабілетті сынау үшін дәйекті түрде енгізілді.
Мақсатты емес бақылау (NC) және shSLC7A5 (Sh1, Sh2) арқылы трансфекцияланған A549 жасушалары түні бойы 10 см диаметрлі ыдыстарға салынды.Жасуша метаболиттері 1 мл мұздатылған 80% сулы метанолмен экстракцияланды.Метанол ерітіндісіндегі жасушалар қырылып, жаңа түтікке жиналды және 15000 × г 4°C температурада 15 минут бойы центрифугалады.800 мкл үстіңгі затты жинап, жоғары жылдамдықтағы вакуумдық концентраторды пайдаланып құрғатыңыз.Содан кейін кептірілген метаболит түйіршіктері жоғарыда сипатталғандай LC-MS/MS көмегімен триптофан деңгейіне талдау жасалды.A549 ұяшықтарындағы (NC және shSLC7A5) жасушалық NAD(H) деңгейлері өндірушінің нұсқауларына сәйкес сандық NAD+/NADH колориметриялық жинақ (#K337, BioVision) арқылы өлшенді.Метаболиттер мөлшерін қалыпқа келтіру үшін әрбір үлгі үшін ақуыз деңгейлері өлшенді.
Іріктеме көлемін алдын ала анықтау үшін статистикалық әдістер қолданылмаған.Биомаркерді ашуға бағытталған алдыңғы метаболомика зерттеулері 15,18 өлшемді анықтау үшін эталондар ретінде қарастырылды және осы есептермен салыстырғанда біздің үлгіміз жеткілікті болды.Зерттеу когортынан ешқандай үлгілер алынып тасталмады.Сарысу үлгілері мақсатсыз метаболомиканы зерттеу үшін анықтау тобына (306 жағдай, 74,6%) және ішкі валидация тобына (104 жағдай, 25,4%) кездейсоқ тағайындалды.Біз сондай-ақ мақсатты метаболомиканы зерттеуге арналған ашылудан әр топтан 70 жағдайды кездейсоқ таңдадық.Тергеушілер LC-MS деректерін жинау және талдау кезінде топтық тапсырмаға соқыр болды.Метаболомика деректерінің және жасуша эксперименттерінің статистикалық талдаулары тиісті Нәтижелер, Сурет аңыздары және Әдістер бөлімдерінде сипатталған.Жасушалық триптофан, NADT және гликолитикалық белсенділікті сандық анықтау бірдей нәтижелермен үш рет тәуелсіз орындалды.
Зерттеу дизайны туралы қосымша ақпарат алу үшін осы мақаламен байланысты Табиғи портфолио есебінің аннотациясын қараңыз.
Алынған мүмкіндіктердің бастапқы MS деректері және анықтамалық сарысудың нормаланған MS деректері тиісінше 1-қосымша және 2-қосымша деректерде көрсетілген.Дифференциалды мүмкіндіктерге арналған ең жоғары аннотациялар Қосымша деректер 3-те берілген. LUAD TCGA деректер жинағын https://portal.gdc.cancer.gov/ сайтынан жүктеп алуға болады.Графикті салуға арналған кіріс деректер бастапқы деректерде берілген.Бұл мақала үшін бастапқы деректер берілген.
Өкпенің скринингін зерттеудің ұлттық тобы және т.б. Төмен дозалы компьютерлік томография көмегімен өкпе ісігінен болатын өлімді азайту.Солтүстік Англия.Дж.мед.365, 395–409 (2011).
Крамер, BS, Berg, KD, Aberle, DR және Пайғамбар, PC Төмен дозалы спиральді КТ көмегімен өкпенің қатерлі ісігінің скринингі: Ұлттық өкпе скринингтік зерттеуінің (NLST) нәтижелері.Дж.мед.Экран 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, HJ және т.б.Рандомизацияланған сынақта көлемді КТ скринингімен өкпенің қатерлі ісігінен болатын өлімді азайту.Солтүстік Англия.Дж.мед.382, 503–513 (2020 ж.).
Жіберу уақыты: 18 қыркүйек 2023 ж